[發明專利]棒狀桿菌誘導型啟動子及含有該啟動子的表達載體與應用

有效

• 申請號: 201810356892.7
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN108517321B
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 張成林;戰俊杰;王道安;李智祥;陳寧;孟靜;何繼龍;李英滋;朱福周;趙磊;徐慶陽;謝希賢;李燕軍;范曉光;馬倩
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/77;C12N1/21;C12P13/00
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 李蕊

本發明涉及一種棒狀桿菌誘導型啟動子及含有該啟動子的表達載體與應用，所述表達載體轉化至谷氨酸棒狀桿菌獲得的5?氨基乙酰丙酸生產菌株并利用該菌株發酵法生產5?氨基乙酰丙酸。用本發明獲得的啟動子構建的表達載體，通過肌醇誘導實現基因的可控表達，克服了現用誘導劑異丙基?β?D?硫代半乳糖苷(Isopropylβ?D?Thiogalactoside，IPTG)對菌體細胞生長的抑制作用以及因其價格高昂造成的生產成本高等不足，同時具有穩定性等特性。利用該啟動子整合于宿主基因組或將表達載體轉化至宿主谷氨酸棒狀桿菌構建獲得5?氨基乙酰丙酸生產菌株，其5?氨基乙酰丙酸產量達到24.2g/L。

技術領域

本發明涉及生物技術生產領域，尤其是棒狀桿菌誘導型啟動子及含有該啟動子的表達載體與應用。

背景技術

目前工業化生產中多用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG誘導的表達質粒，需要在生產過程中添加IPTG，價格昂貴，不利于工業化生產，并且IPTG對菌體細胞生長影響嚴重同時發酵液中含有大量殘余IPTG，為后期產物的分離提取帶來困難。盡管乳糖能夠代謝IPTG，但對于大多數棒狀桿菌而言，乳糖不能夠進入胞內，進一步限制了其在棒狀桿菌中的應用。

肌醇，也稱為環己六醇，屬于維生素類，是合成細胞質膜中豐富的磷脂——磷脂酰肌醇所必需的，又是棒狀桿菌如脂多糖和脂褐素單胞菌中更復雜的細胞糖脂的前體。此外，肌醇也是咪唑硫醇的結構單元，它是一種對棒狀桿菌特異性的低分子量硫醇，對于保護活性氧的類似于真核生物和革蘭氏陰性細菌中的谷胱甘肽的破壞作用是必需的。

5-氨基乙酰丙酸作為一種具有高附加值的氨基酸衍生物，在醫療和農業方面具有重要的應用價值與開發前景。近年來，作為一種安全、選擇性和滲透性好的光動力學藥物在醫學領域逐漸得到了重視。目前，己經應用于多種癌癥的診斷和治療。在農業上，已經成為一種無公害的綠色農藥，作為除草劑、植物生長調節劑等。同時，也是工業上一些有機物合成的中間體。化學合成法反應歷程比較長，其反應歷程中要不可避免的采取一些有毒且價格昂貴的原料，同時也不可避免的造成環境污染。此外，5-氨基乙酰丙酸的結構中含有活潑的氨基和羧基，合成過程中必須將其保護起來，這樣就增加了反應的步驟、副產物和成本，導致得率不高。而目前生物法因生產效率低不能工業化生產需求。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供棒狀桿菌誘導型啟動子。

本發明所要解決的另一技術問題在于提供含有上述棒狀桿菌誘導型啟動子的棒狀桿菌誘導型表達質粒。

本發明所要解決的另一技術問題在于提供利用上述棒狀桿菌誘導型表達質粒得到的用于生產5-氨基乙酰丙酸的質粒。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：

一種棒狀桿菌誘導型啟動子P_iol，受肌醇誘導調控，其序列如序列表4001所示。

一種棒狀桿菌誘導型表達質粒pIol，含有上述棒狀桿菌誘導型啟動子。

優選的，上述棒狀桿菌誘導型表達質粒pIol，是將上述棒狀桿菌誘導型啟動子插入至質粒pXMJ19的Hpa Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點得到的，其序列如序列表4002所示。

一種用于生產5-氨基乙酰丙酸的質粒pIolhemAL，在上述棒狀桿菌誘導型表達質粒的BamH I和Kpn I酶切位點酶切位點插入谷氨酰-tRNA還原編碼基因hemA和谷氨酸-1-半醛-氨基轉移酶hemL，其序列如序列表4003所示，hemA序列如序列表4004所示，hemL序列如序列表4005所示。

上述用于生產5-氨基乙酰丙酸的質粒pIolhemAL的構建方法如下：

(1)克隆谷氨酰-tRNA還原編碼基因hemA和谷氨酸-1-半醛-氨基轉移酶hemL，hemA序列如4004所示，hemL序列如4005所示；