[發明專利]一種獺兔皮膚真皮毛乳頭細胞分離培養方法

在審

• 申請號: 201810355965.0
• 申請日: 2018-04-19
• 公開（公告）號: CN108359633A
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發明（設計）人: 李福昌;劉公言;吳振宇;李凡;劉磊
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 濟南千慧專利事務所(普通合伙企業) 37232
• 代理人: 商福全

本發明涉及細胞生物學技術領域，尤其是一種獺兔皮膚真皮毛乳頭細胞分離培養方法。該獺兔皮膚真皮毛乳頭細胞分離培養方法包括:(1)取獺兔背部皮膚，剪成長條，置于Ⅱ型分離酶溶液中，于4℃過夜消化，次日于37℃培養箱中消化后，去除表皮；(2)將經步驟(1)去除表皮處理后剩余的皮膚真皮部分剪碎成泥，置于D型膠原酶中消化4?6h，至消化皮膚呈液態并在顯微鏡下觀察有毛乳頭游離出，用含胎牛血清的DMEM終止消化；(3)將經步驟(2)處理后的液態皮膚離心，收集細胞，棄去上清液，細胞培養基重懸，即得。相比于現有技術，該分離培養方法科學、合理，培養成功率高且分離過程中無細胞機械損傷。

技術領域：

本發明涉及細胞生物學技術領域，尤其是一種獺兔皮膚真皮毛乳頭細胞分離培養方法。

背景技術：

毛發附著在皮膚的外表面，不僅對動物和人具有防御和保護功能，還具有增加信息交流和美觀的作用(Messenger，1993)。毛發由毛囊生成，毛囊(Hair follicle)是表皮向真皮凹陷后形成的能控制毛發生長的皮膚附屬器官，是由胚胎期神經外胚層與間充質相互作用，最終發育形成的由多層細胞組成的、具有合成多種特異角質蛋白功能的復雜的動態器官，具有獨特的結構和周期性再生(即經歷生長期、衰退期和休止期的周期性循環)的特性。毛囊在形成與分化過程中，至少涉及到20種不同的細胞群，主要有毛乳頭、毛母質、內根鞘、外根鞘等細胞組成。

由于毛囊具有周期性生長的特性，為組織再生提供了良好的模型。毛囊的周期性生長由毛囊干細胞介導發生，毛囊干細胞的靜息與活化受到干細胞微環境的調控(Paus等，2004)。毛囊干細胞位于毛囊隆突區，但目前人們對影響毛囊干細胞自我更新和分化的微環境了解并不多、更不徹底。其中，由休止期向生長期的轉化，也就是生長期的啟動是毛囊生長最關鍵的環節。當毛囊的周期性再生功能發生障礙時，就會出現脫發、斑禿等毛囊疾病。Jahoda等2011報道，將毛乳頭細胞制成微囊植入大鼠耳部皮下，能夠誘導耳毛囊再生，并有將人的毛乳頭細胞條件培養液用于臨床斑禿的治療。隨著社會的發展，人們對具有保護與美觀作用的毛發越來越重視，對毛囊周期性再生的研究越來越重要。

毛乳頭(Dermal papilla)是毛囊真皮成分中最重要的部分，在毛囊中控制著毛囊發育、生長和重建，并在一定程度上決定了毛囊的大小。毛乳頭細胞是真皮中的一群特異化的間充質來源的細胞，在毛囊周期變化過程中發揮關鍵作用，是整個毛囊中直接參與毛囊生長周期調控的關鍵組分。大量研究表明，在動物毛囊周期生長中，毛乳頭細胞與毛囊干細胞發生定期規律性的信號交流，在毛囊周期啟動中最為密切(Millar，2002；Aoi等，2012；Hill等，2013)，說明毛乳頭細胞可為毛囊干細胞提供微環境支持，并在毛囊周期性再生的起始階段發揮作用。毛乳頭是一個分泌因子的中心，可以生成大量的信號因子，通過激活或抑制毛囊周期性生長信號通路發揮調節作用(Peus等，1996；Roh等，2004；Dipo等，2005)。

然而，由于毛乳頭位于毛囊的基底部，體積小、又被毛囊包裹，因此分離困難。目前，在毛乳頭的分離過程中最常用的方法主要是顯微解剖法，此方法對儀器設備及無菌環境要求較高，需要操作者擁有較熟練的顯微分離技術，工作強度大，耗時較長，同時獲得的毛乳頭細胞貼壁率較低，毛乳頭細胞遷出困難。此外，顯微解剖分離法可以分離觸須毛囊、小鼠皮膚毛囊、山羊皮膚毛囊等較大的毛囊，而對于像獺兔皮膚毛囊數量多，個體小的毛囊毛乳頭的分離并不適用，分離困難；另外機械分離造成毛乳頭細胞損傷，細胞貼壁率低，培養獺兔真皮毛乳頭細胞成功率不高。因此，獲取獺兔皮膚毛囊毛乳頭細胞不僅成為研究獺兔毛囊周期性生長變化、影響因素及調控機制的關鍵素材，為提高獺兔皮張質量的育種改良奠定基礎，也還可以為醫學領域的人類毛發再生研究提供模型。

發明內容：