[發明專利]包含家蠅抗菌肽基因的重組載體、菌株及其表達和應用

在審

• 申請號: 201810355337.2
• 申請日: 2018-04-19
• 公開（公告）號: CN108315345A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 徐楠;吳建偉;彭建
• 申請（專利權）人: 貴州博康生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C07K14/435;C12P21/00;A23K10/18;A23K20/147;A23K50/75;C12R1/84
• 代理公司: 北京聯創佳為專利事務所(普通合伙) 11362
• 代理人: 郭防

本發明提供了一種包含家蠅抗菌肽MAF?1基因的重組載體、包含該重組載體的重組酵母菌株及家蠅抗菌肽MAF?1基因在重組酵母菌株中的表達方法和表達產物的應用。經證實，本發明能夠有效提高所表達出的家蠅抗菌肽MAF?1的活性和表達產物家蠅抗菌肽MAF?1的生產效率，在該條件下發酵表達家蠅抗菌肽MAF?1，可達到50～75mg/ml的發酵水平，大大降低生產成本。同時，本發明還提供了上述重組酵母菌株或其表達的家蠅抗菌肽MAF?1在家禽飼料添加劑中的應用，通過在家禽飼料添加劑中使用該重組酵母菌的干燥滅活菌體或其所表達出的家蠅抗菌肽MAF?1為防治家禽念珠菌病開辟了一條新的路徑。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種包含家蠅抗菌肽MAF-1基因的重組載體、該重組載體的構建方法及家蠅抗菌肽MAF-1基因在含有該重組載體的酵母中的表達方法和表達產物的應用。

背景技術

家禽念珠菌病由白色念珠菌起引的禽類上消化道的一種霉菌病，特征是在上消化道粘膜發生白色假膜和潰瘍，多發生于雞、鴨。雖然不會直接給帶來大面積的死亡，但能給禽類帶來嚴重的免疫抑制，造成免疫應答水平低下，體質消弱，抗病差。從而引起肉禽瘦弱，蛋禽產蛋下降。給養殖戶帶來巨大的損失。且本病沒有特異性的防制辦法，一旦發生，單純的治療效果往往不佳，現有的家禽用抗真菌藥物制霉菌素、達美素等效果均不如人意。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMP)是生物免疫系統產生的一類抵抗外界病原體感染的小分子多肽，具有抗菌、抗病毒、抗寄生蟲、抑制腫瘤細胞及免疫調節活性。其作用機制獨特、理化性質穩定，僅作用于病原微生物，對人正常細胞無副作用。AMP這種選擇性特點在抗病原微生物藥物研發中具有較大的發展潛力。AMP的獲取主要是從動物體內分離提取，且資源有限、價格昂貴，限制其規模化生產。

家蠅抗菌肽MAF-1(Musca domestica antifungal peptide-1)是經免疫誘導后從家蠅幼蟲血淋巴中分離得到抗菌肽，結構特征獨立于目前發現的昆蟲抗菌肽種類，GenBank登錄號HM178948。家蠅抗菌肽MAF-1分子量為17203.384Da，其成熟肽由156個氨基酸殘基組成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。經證明該抗菌肽能夠殺滅白色念珠菌敏感株，對耐藥菌株也同樣有效。由于家蠅抗菌肽MAF-1是來源于動物的結構性蛋白，具有安全性高，抑菌效果好，并且不會引起菌株抗藥性和機體其他免疫反應的特點，因此具有作為家禽念珠菌病預防用藥的應用前景。

前期發明人經免疫誘導后從家蠅幼蟲血淋巴中分離得到家蠅MAF-1序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2，序列全長661bp，其中第47～49堿基為啟動子ATG和第581～581堿基為終止子TAA，開放閱讀框編碼178個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3，是經前述含156個氨基酸殘基的成熟肽序列逆轉錄成cDNA序列再經過3’race和5’race擴增得到全長基因，再通過對全長基因進行生物信息學分析，得到該基因所編碼的蛋白質序列全長，即包含信號肽和成熟肽的完全肽，分子量為17.2KDa。發明人通過家蠅MAF-1序列已成功構建MAF-1-PET28a-BL21原核表達質粒，研究其原核表達蛋白MAF-1發現其具有抑制白色念珠球菌活性的作用，其最低抑菌活性為70ug/ml，但由于其原核表達體系在蛋白轉錄后蛋白修飾功能方面的缺陷，導致所表達出的家蠅抗菌肽MAF-1的活性不高(彭傳林，魏川川，吳建偉，等。家蠅抗真菌肽MAF-1原核表達條件優化及活性驗證。中國公共衛生，2015，31(11)：1420～1423)。

綜上而言，由于昆蟲抗菌肽的天然資源有限，而化學合成肽類的成本較高，通過基因工程在原核生物中表達抗菌肽生產率低且原核生物所表達的抗菌肽活性不高，因此，如何提高抗菌肽的生產效率，降低成本，是應用抗菌肽必須解決的問題。

發明內容