[發(fā)明專利]一種FFPE樣本circRNA高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810354803.5
• 申請(qǐng)日: 2018-04-19
• 公開（公告）號(hào): CN108546700A
• 公開（公告）日: 2018-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁向明;孫萍;劉明;李杰;申健
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州密碼子基因科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 廣州新諾專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44100
• 代理人: 張玲春

本發(fā)明公開了一種福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)樣本circRNA高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，具體包括以下步驟：(1)從石蠟切片中提取總RNA；(2)將樣本RNA加上一段PolyA尾；(3)Oligo dT磁珠捕獲分離線性RNA；(4)進(jìn)一步去除殘留的線性RNA；(5)構(gòu)建circRNA高通量測(cè)序文庫(kù)。本發(fā)明針對(duì)FFPE樣本RNA有損傷、含量低、完整性差的特點(diǎn)，提供的一種FFPE樣本circRNA高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、成本低，且能穩(wěn)定獲得滿足高通量測(cè)序要求的文庫(kù)，避免了傳統(tǒng)文庫(kù)構(gòu)建方法中樣本需求量大、去除rRNA成本高、效率低等問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，屬于生物技術(shù)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)樣本circRNA高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

近年來，癌癥的發(fā)病率明顯增多，嚴(yán)重威脅人類健康，腫瘤的研究也成為了全球熱點(diǎn)。盡管腫瘤的研究方法和研究角度不斷的更新，但人體腫瘤組織標(biāo)本仍是腫瘤研究不可或缺的重要對(duì)象。福爾馬林固定石蠟包埋(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，F(xiàn)FPE)是病理科普遍采用的組織處理和保存方法。FFPE組織樣本制備簡(jiǎn)單、造價(jià)低廉且易于存放，在世界各地的醫(yī)院及組織樣品庫(kù)中廣泛保存，是用于疾病診斷和科學(xué)研究的最為常見的生物學(xué)資源之一。隨著新一代測(cè)序技術(shù)(NGS)的快速發(fā)展，在細(xì)胞分子水平提供了前所未有的檢測(cè)能力，也為腫瘤的個(gè)性化治療提供可能性。研究人員可以使用這一技術(shù)手段，重新研究腫瘤FFPE樣本，尋找疾病與基因的關(guān)系。

CircRNA是一類具有環(huán)形閉合結(jié)構(gòu)的RNA，廣泛存在于真核生物轉(zhuǎn)錄組中。與傳統(tǒng)的線性RNA不同，circRNA對(duì)核酸酶不敏感，比線性RNA更為穩(wěn)定，這使其在作為新型臨床診斷標(biāo)記物的開發(fā)應(yīng)用上更具優(yōu)勢(shì)。研究表明，circRNA參與癌癥等多種疾病的調(diào)控，已經(jīng)成為近年來的研究熱點(diǎn)。然而，在FFPE組織標(biāo)本的制備和貯存過程中，組織經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋后很容易引起RNA的交聯(lián)和降解，科研人員很難獲得足量高質(zhì)量的RNA樣本。這使得利用豐富的FFPE組織樣本篩選潛在circRNA腫瘤標(biāo)志物的研究成為困難。

目前，傳統(tǒng)circRNA高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法是去除樣品中的rRNA后用RNase R去除線性RNA，從而富集circRNA。這種方法對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，適用于濃度高，總量多，完整性好的樣品。雖然RNase R能消化大部分的線性RNA，但效果并不是很理想，在專利CN 106801050 A公開的發(fā)明方法中有效數(shù)據(jù)circular junction reads僅0.07％左右，F(xiàn)FPE組織等低質(zhì)量樣本更低。而專利CN 104388548 A公開了一種高通量環(huán)狀RNA測(cè)序方法，采用生物素標(biāo)記后用鏈霉親和素磁珠除去線性RNA，使得環(huán)狀RNA的有效測(cè)序數(shù)據(jù)量提高了14倍。該方法步驟繁瑣復(fù)雜，且需要預(yù)先人工合成外源線性RNA及外源環(huán)狀RNA，亦不適用于如FFPE組織一類低質(zhì)量樣本。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明目的是提供一種FFPE樣本circRNA高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法。該方法適用于濃度低、含量少、完整性差的RNA樣品，且操作步驟簡(jiǎn)單。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種FFPE樣本circRNA高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)從石蠟切片中提取總RNA；

(2)將樣本RNA加上一段PolyA尾；

(3)Oligo dT磁珠捕獲分離線性RNA；

(4)進(jìn)一步去除殘留的線性RNA；

(5)構(gòu)建circRNA高通量測(cè)序文庫(kù)。

該方法適用于來源于福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織切片樣品。