[發明專利]一種FFPE樣本circRNA高通量測序文庫的構建方法

在審

• 申請號: 201810354803.5
• 申請日: 2018-04-19
• 公開（公告）號: CN108546700A
• 公開（公告）日: 2018-09-18
• 發明（設計）人: 丁向明;孫萍;劉明;李杰;申健
• 申請（專利權）人: 廣州密碼子基因科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 張玲春

1.一種FFPE樣本circRNA高通量測序文庫的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)從石蠟切片中提取總RNA；

(2)將樣本RNA加上一段PolyA尾；

(3)Oligo dT磁珠捕獲分離線性RNA；

(4)進一步去除殘留的線性RNA；

(5)構建circRNA高通量測序文庫。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于：步驟(1)中，所述石蠟切片為福爾馬林固定石蠟包埋的組織樣本；所述提取總RNA采用提取試劑盒QIAGEN miRNeasy FFPE Kit。

3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于：步驟(2)中，所述加polyA尾采用polyA聚合酶法；具體為在去除核酸酶的PCR管中加入總RNA、poly(A)聚合酶緩沖液、E.coli poly(A)聚合酶、ATP，混勻，瞬離，37℃，反應30min。

4.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于：步驟(3)中，所述Oligo dT磁珠捕獲分離線性RNA具體為用Oligo dT磁珠捕獲分離樣品RNA中帶有polyA尾的線性RNA；所述OligodT磁珠捕獲帶polyA尾線性RNA采用梯度變溫法。

5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于：所述梯度變溫法具體為，將Oligo dT磁珠與帶polyA尾線性RNA混合雜交，其反應條件為在68℃的溫度下雜交5min，然后以0.1℃/s的速度將溫度緩慢降至45℃，在45℃保持5min，再以0.1℃/s的速度將溫度緩慢降至25℃，并在25℃保持5min。

6.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于：步驟(3)中，所述Oligo dT磁珠捕獲分離線性RNA還包括分離線性RNA后用VAHTS RNA Clean Beads磁珠回收circRNA。

7.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于：步驟(4)中，所述進一步去除殘留線性RNA采用RNase R消化法；具體為加入RNase R、RNase R Reaction Buffer(10×)，混勻，瞬離，反應10-30min，反應的溫度為37℃。

8.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于：步驟(5)中，所述構建circRNA高通量測序文庫包括以下步驟：

(Ⅰ)RNA片段化；

(Ⅱ)逆轉錄合成雙鏈cDNA，并進行磁珠純化；

(Ⅲ)末端修復、3’末端加A、連接接頭，并進行磁珠純化；

(Ⅳ)PCR擴增，并進行磁珠純化。

9.根據權利要求8所述的構建方法，其特征在于：步驟(5)中，所述構建circRNA高通量測序文庫所用純化磁珠為Ampure XP磁珠。

10.根據權利要求8所述的構建方法，其特征在于：

步驟(Ⅰ)中，所述RNA片段化為加入Fragment,Prime and Elute Buffer(2×)，混勻，熱蓋溫度為105℃，反應溫度為85℃，反應時間5min；

步驟(Ⅱ)中，所述磁珠純化采用1.8×磁珠；

步驟(Ⅲ)中，所述磁珠純化為兩步法純化；所述兩步法純化具體為，先加入1.0×磁珠緩沖液進行純化，再用0.60×/0.20×磁珠篩選出合適大小的目的片段；

步驟(Ⅳ)中，所述磁珠純化采用0.9×磁珠。