[發明專利]嗜熱子囊菌基因表達系統

有效

• 申請號: 201810354443.9
• 申請日: 2018-04-19
• 公開（公告）號: CN108949579B
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 洪泂;胡圣霖;王冬梅
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/15;C12N15/80;C12R1/645
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 高麗娜

本發明提供一種嗜熱子囊菌乳清酸核苷?5’?磷酸脫羧酶基因(pyrG)缺陷型菌株，其保藏號為CGMCC.13375。本發明還提供包含所述缺陷型菌株的嗜熱子囊菌基因表達系統以及相應的目的基因的轉化和表達方法，以及編碼與所述pyrG缺陷型菌株相對應的乳清酸核苷?5’?磷酸脫羧酶的分離的核酸。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，本發明涉及通過紫外誘變方法，篩選出一株乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶基因(pyrG)突變的尿嘧啶營養缺陷型的嗜熱子囊菌菌株，并且涉及利用所述菌株的嗜熱子囊菌基因表達系統。

背景技術

嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus)是子囊菌類的耐熱真菌。最早于1907年由Hugo Miehe在自發生熱的干草垛中分離得到。嗜熱子囊菌的孢子呈亮橘黃色橢球形，一般認為沒有無性繁殖階段。報導的嗜熱子囊菌孢子萌發的最佳和最高溫度分別為47.5℃和60℃左右。相應的菌絲生長的最適和最高溫度則較低，分別在40-45℃和55℃。孢子萌發和菌絲生長的下限溫度則分別為32.5℃-35℃和20℃-25℃。另外孢子萌發率會受菌株培養年齡的些微影響。

嗜熱子囊菌是一種能夠高表達耐熱纖維素酶的子囊菌綱真菌，可以生產一大批工業上有應用價值的酶類。這些耐熱酶出色的高溫穩定性和變性劑耐受性賦予其很好的工業潛力。而且嗜熱子囊菌在以源自農林業廢棄物，木質纖維素類生物質為基礎的培養條件下可有效生長。在此類低成本的常見材料上的出色適應性使其在工業上生產纖維素酶時具有重大優勢。在木質纖維素類生物質精煉方面，相對于化學轉化在溫度壓力要求上也都溫和許多。耐熱酶因其在工業條件下的應用優勢：(1)大量轉化反應可以在更高溫度下進行以降低體系粘度；(2)污染風險降低；(3)酶可以在室溫有效保存而不失活。但是由于特異培養的生長速率低，大量生產商用耐熱生物酶仍舊是一個經濟上的挑戰。所以要充分發掘它的生物技術潛能，特別是在分子和基因層面上，還有很多工作需要完成。其中很重要的一個障礙就是嗜熱子囊菌還沒有建立轉化和遺傳操作系統。因此建立一個有效的絲狀真菌遺傳操作系統具有重要價值。

當前絲狀真菌中使用的轉化方法主要有：⑴原生質體-PEG轉化法；⑵農桿菌介導的轉化；⑶電擊轉化法；⑷醋酸鋰轉化法；⑸脂質體轉化法；⑹基因槍法等(Dhawale等1984,Chakraborty等1991,Hazell等2000,Michielse等2008,Yin等2012,Chai等2013)。

若要進一步開發嗜熱子囊菌的工業潛力，在分子和遺傳方面還有許多工作要做。但是該菌種始終沒有有效可用的遺傳操作系統。本發明通過紫外誘變的方法構建了穩定遺傳的嗜熱子囊菌pyrG缺陷型菌株。使用蝸牛酶處理菌絲成功地獲得了具有再生活力的原生質體，克隆了可作為選擇標簽的該菌自身的pyrG基因、纖維二糖水解酶和內切葡萄糖苷酶的啟動子，并成功的建立了嗜熱子囊菌的高效轉化系統并表達了外源基因。

發明內容

本發明目的是為了在嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus)中構建一個外源基因的表達系統，這個系統包括宿主菌乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶基因(pyrG)突變的尿嘧啶營養缺陷型菌株TA3(于2016年12月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號：CGMCC.13375)，外源基因在該菌株的原生質體-PEG轉化方法，轉化子的篩選方法，即利用克隆得到的pyrG基因作為選擇標簽轉化入該誘變株使得其恢復合成尿嘧啶的能力來篩選轉化子。構建了外源基因表達的質粒及啟動子系統。

本發明成功得到一株乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶基因(pyrG)突變的尿嘧啶營養缺陷型菌株作為宿主菌，克隆了對應的pyrG基因作為轉化的選擇標簽，克隆了纖維二糖水解酶和內切葡聚糖酶的啟動子用于表達外源基因，并且建立了基因轉化方法，通過淀粉酶AoAMY基因的重組表達驗證了該轉化系統及表達外源基因的有效性。