[發(fā)明專利]一種用于淡水螯蝦細(xì)胞外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)染方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810350972.1
• 申請日: 2018-04-18
• 公開（公告）號: CN108486115B
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 施泓;阮靈偉;徐洵
• 申請（專利權(quán)）人: 自然資源部第三海洋研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85
• 代理公司: 廈門南強(qiáng)之路專利事務(wù)所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森

1.適用于淡水螯蝦造血組織細(xì)胞外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)染方法，其特征在于將外源重組質(zhì)粒導(dǎo)入淡水螯蝦造血組織細(xì)胞中，并且實(shí)現(xiàn)目的基因大量表達(dá)的過程，具體包括以下步驟：

1)使用適用于淡水螯蝦造血組織細(xì)胞外源基因表達(dá)的表達(dá)載體，構(gòu)建包含目的基因片段的重組質(zhì)粒；

所述適用于淡水螯蝦造血組織細(xì)胞外源基因表達(dá)的表達(dá)載體為適用于淡水螯蝦造血組織細(xì)胞外源基因表達(dá)的強(qiáng)啟動子序列信息合成DNA后，將該DNA片段插入經(jīng)過改造的昆蟲表達(dá)質(zhì)粒pIZ/V5-His，獲得重組表達(dá)載體pIZ-wsv249p/V5-His，該重組質(zhì)粒在大腸桿菌(Escherichia coli)中大量復(fù)制，或在淡水螯蝦造血組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá)，所述經(jīng)過改造為去掉載體自身帶有的多克隆位點(diǎn)前的啟動子；

所述適用于淡水螯蝦造血組織細(xì)胞外源基因表達(dá)的強(qiáng)啟動子序列為一段DNA核苷酸序列，該序列來源自白斑綜合癥病毒的極早期基因wsv249的啟動子區(qū)域，經(jīng)過篩選比較，發(fā)現(xiàn)其在淡水螯蝦造血組織細(xì)胞中具有強(qiáng)啟動子活性，應(yīng)用于下游重組表達(dá)載體的構(gòu)建，該序列長度為332bp，類型為核酸，鏈性為雙鏈，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為線性，序列如下所示，記為SEQ IDNo.1：

2)淡水螯蝦造血組織細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和預(yù)處理；

3)使用適用于淡水螯蝦造血組織細(xì)胞外源基因表達(dá)的電穿孔系統(tǒng)以及特定的操作參數(shù)，對淡水螯蝦造血組織細(xì)胞進(jìn)行重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染；

所述適用于淡水螯蝦造血組織細(xì)胞外源基因表達(dá)的電穿孔系統(tǒng)是Celetrix^TM電轉(zhuǎn)儀、相關(guān)的電擊管與電轉(zhuǎn)液在淡水螯蝦造血組織細(xì)胞外源基因轉(zhuǎn)染表達(dá)中的應(yīng)用，特定的操作參數(shù)為電壓400V，電脈沖時間30ms，電脈沖次數(shù)1次；

4)目的基因在淡水螯蝦造血組織細(xì)胞表達(dá)的檢測。