[發明專利]一種用于淡水螯蝦細胞外源基因表達的轉染方法及其應用

有效

• 申請號: 201810350972.1
• 申請日: 2018-04-18
• 公開（公告）號: CN108486115B
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 施泓;阮靈偉;徐洵
• 申請（專利權）人: 自然資源部第三海洋研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

一種用于淡水螯蝦細胞外源基因表達的轉染方法及其應用，涉及水產動物學領域的生物技術。提供適用于淡水螯蝦造血組織細胞外源基因表達的強啟動子序列、適用于淡水螯蝦造血組織細胞外源基因表達的表達載體、適用于淡水螯蝦造血組織細胞外源基因表達的電穿孔系統以及特定的操作參數和適用于淡水螯蝦造血組織細胞外源基因表達的轉染方法。使用含有白斑綜合癥病毒的極早期基因wsv249啟動子序列的重組質粒和Celetrix^TM電穿孔系統，對轉染淡水螯蝦造血組織細胞的操作步驟和技術參數進行摸索，建立一套成功實現淡水螯蝦造血組織細胞外源基因表達的操作參數和方法。

技術領域

本發明涉及水產動物學領域的生物技術，尤其是涉及一種用于淡水螯蝦細胞外源基因表達的轉染方法及其應用。

背景技術

我國是水產養殖大國，蝦類養殖業(包括海水對蝦和淡水螯蝦)是我國許多地區的重要經濟產業。但近年來病害問題包括細菌病，真菌病，病毒病等持續突出，使得海水對蝦養殖成功率低，2015年中國對蝦養殖成功率不到一成，整體產業處于低迷、不景氣的狀態。相較于海水對蝦，淡水螯蝦屬于外來物種，對養殖環境要求相對較低，但是近年來由于養殖面積大量擴張，養殖密度不斷增大，使得以前很少發病的淡水螯蝦情況也不甚理想。病害問題嚴重影響著蝦類養殖產業的發展，而獲得有效的病害防御方法和抗病良種成為了近年來養殖戶的迫切需求。為此中國、美國、瑞典、日本、泰國、越南等國科學家對蝦的免疫防御機制以及病害的入侵機制都開展了廣泛的研究，但目前所獲得的信息還非常有限，這嚴重影響了對生產實踐的指導。究其原因，很大程度上是由于缺乏相關外源基因轉染表達的研究平臺，使一些關鍵問題無法深入探討。因此，本發明創造性地建立一套轉染方法，首次攻克這一技術難題，并為其擴展應用提供了可能。

發明內容

本發明的第一目的是提供一段適用于淡水螯蝦造血組織細胞外源基因表達的強啟動子序列。

本發明的第二目的是提供一個適用于淡水螯蝦造血組織細胞外源基因表達的表達載體。

本發明的第三目的是提供一套適用于淡水螯蝦造血組織細胞外源基因表達的電穿孔系統以及特定的操作參數。

本發明的第四目的是提供一種適用于淡水螯蝦造血組織細胞外源基因表達的轉染方法。

所述一段適用于淡水螯蝦造血組織細胞外源基因表達的強啟動子序列為一段DNA核苷酸序列，該序列來源自白斑綜合癥病毒的極早期基因wsv249的啟動子區域，經過篩選比較，發現其在淡水螯蝦造血組織細胞中具有強啟動子活性，可應用于下游重組表達載體的構建。該序列長度為332bp，類型為核酸，鏈性為雙鏈，拓撲結構為線性，序列如下所示，記為SEQ ID No.1：

所述適用于淡水螯蝦造血組織細胞外源基因表達的表達載體為所述適用于淡水螯蝦造血組織細胞外源基因表達的強啟動子序列信息合成DNA后，將該DNA片段插入經過改造的昆蟲表達質粒pIZ/V5-His，獲得重組表達載體pIZ-wsv249p/V5-His，該重組質粒可以在大腸桿菌(Escherichia coli)中大量復制，也可以在淡水螯蝦造血組織細胞中實現目的基因的表達，所述經過改造為去掉載體自身帶有的多克隆位點前的啟動子。

所述適用于淡水螯蝦造血組織細胞外源基因表達的電穿孔系統以及特定的操作參數是Celetrix^TM電轉儀、相關的電擊管與電轉液在淡水螯蝦造血組織細胞外源基因轉染表達中的應用，特定的操作參數為電壓400V，電脈沖時間30ms，電脈沖次數1次。

所述適用于淡水螯蝦造血組織細胞外源基因表達的轉染方法是將外源重組質粒導入淡水螯蝦造血組織細胞中，并且實現目的基因大量表達的過程，具體包括以下步驟：

1)使用所述適用于淡水螯蝦造血組織細胞外源基因表達的表達載體，構建包含目的基因片段的重組質粒；

2)淡水螯蝦造血組織細胞的分離、培養和預處理；