[發明專利]一種利用透性化細胞制備利巴韋林的方法

在審

• 申請號: 201810349472.6
• 申請日: 2018-04-18
• 公開（公告）號: CN108517326A
• 公開（公告）日: 2018-09-11
• 發明（設計）人: 范曉光;謝希賢;陳寧;賈子樊;吳思佳;張通;徐慶陽;張成林
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P19/38;C12N15/55;C12N15/54;C12N9/12;C12N9/18
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 李蕊

本發明涉及一種利用透性化細胞制備利巴韋林的方法，向宿主細胞Escherichia coli Rosetta(DE3)的基因組上整合來源于嗜熱單孢菌Thermobifida fusca的角質酶基因Tfu，并使用T7啟動子調控Tfu基因的表達；構建含有枯草芽孢桿菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的質粒pET?His?pupG并將其轉入改造的宿主細胞中獲得基因工程菌；培養基因工程菌并使用乳糖誘導同時表達角質酶以及嘌呤核苷磷酸化酶；直接收集細胞多批次催化合成利巴韋林。

技術領域

本發明涉及生物制藥技術領域，尤其是一種利用透性化細胞制備利巴韋林的方法。

背景技術

利巴韋林(Ribavirin)，化學名為1-β-D-呋喃核糖基-1-H-1,2,4-三氮唑-3-羧酰胺，是一種對DNA和RNA病毒均有較好的抑制作用的廣譜抗病毒藥物，具有作用位點多、不易產生耐藥性、療效高、毒性低，副作用小等特點，現已用于多種病毒的治療。

目前利巴韋林的生產方法主要包括化學合成法、發酵法和酶法。化學合成法為目前報道最多、生產工藝最為成熟的一種方法，但存在反應條件苛刻，周期長，提取復雜，收率低，成本高，環境污染嚴重等不足；發酵法是向培養基中添加前體物1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺(TCA)，利用枯草芽孢桿菌等特定微生物代謝合成利巴韋林，但依然存在生產周期長、容易污染雜菌、提取工藝復雜以及能耗高等缺點。

酶催化法是以嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)為催化劑，以廉價底物鳥苷和TCA為原料合成利巴韋林。與化學法和發酵法相比具有反應時間短、副產物少、產物容易分離、原料來源廣泛(供體核糖可以從多種核苷、核苷酸中獲得)、操作簡單、環境污染少、能耗少等優點。

在前期的研究中，申請人使用工程菌E.coli BL21/pET-His-pupG過表達嘌呤核苷磷酸化酶，并通過固定化細胞技術多批次催化合成利巴韋林(ZL201610060219.X)。但固定化操作的引入增加了生產成本，延長了生產周期。在現有技術的基礎上，研究一種酶源可重復利用的全細胞催化制備利巴韋林的方法具有非常重要的生產實踐價值。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種利用透性化細胞制備利巴韋林的方法。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：

一種利用透性化細胞制備利巴韋林的方法，向宿主細胞Escherichia coliRosetta(DE3)的基因組上整合來源于嗜熱單孢菌Thermobifida fusca的角質酶基因Tfu，并使用T7啟動子調控Tfu基因的表達；構建含有枯草芽孢桿菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的質粒pET-His-pupG并將其轉入改造的宿主細胞中獲得基因工程菌；培養基因工程菌并使用乳糖誘導同時表達角質酶以及嘌呤核苷磷酸化酶；直接收集細胞多批次催化合成利巴韋林。

優選的，上述利用透性化細胞制備利巴韋林的方法，具體步驟如下：

(1)在Escherichia coli Rosetta(DE3)(購自于優寶生物，產品編號ST1011)的基因組上整合含有T7啟動子控制的嗜熱單孢菌Thermobifida fusca(ATCC 27730)的角質酶基因P_T7-Tfu，得到宿主菌Rosetta*；

(2)構建含有枯草芽孢桿菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的質粒pET-His-pupG，并將質粒導入宿主菌，獲得工程菌Rosetta*/pET-His-pupG；

(3)以工程菌為產酶菌株，使用發酵罐培養，利用乳糖誘導產酶后收集細胞：

(4)配制反應體系，經酶促反應得到利巴韋林轉化液；離心收集細胞后再進行下一批次的催化反應。

優選的，上述利用透性化細胞制備利巴韋林的方法，還包括步驟(5)對每一批次的轉化液進行檢測，計算利巴韋林的濃度以及反應轉化率。