[發明專利]一種利用透性化細胞制備利巴韋林的方法

在審

• 申請號: 201810349472.6
• 申請日: 2018-04-18
• 公開（公告）號: CN108517326A
• 公開（公告）日: 2018-09-11
• 發明（設計）人: 范曉光;謝希賢;陳寧;賈子樊;吳思佳;張通;徐慶陽;張成林
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P19/38;C12N15/55;C12N15/54;C12N9/12;C12N9/18
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 李蕊

1.一種利用透性化細胞制備利巴韋林的方法，其特征在于：向宿主細胞Escherichiacoli Rosetta(DE3)的基因組上整合來源于嗜熱單孢菌Thermobifida fusca的角質酶基因Tfu，并使用T7啟動子調控Tfu基因的表達；構建含有枯草芽孢桿菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的質粒pET-His-pupG并將其轉入改造的宿主細胞中獲得基因工程菌；培養基因工程菌并使用乳糖誘導同時表達角質酶以及嘌呤核苷磷酸化酶；直接收集細胞多批次催化合成利巴韋林。

2.根據權利要求1所述的利用透性化細胞制備利巴韋林的方法，其特征在于：具體步驟如下：

(1)在Escherichia coli Rosetta(DE3)的基因組上整合含有T7啟動子控制的嗜熱單孢菌Thermobifida fusca(ATCC 27730)的角質酶基因P_T7-Tfu，得到宿主菌Rosetta*；

(2)構建含有枯草芽孢桿菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的質粒pET-His-pupG，并將質粒導入宿主菌，獲得工程菌Rosetta*/pET-His-pupG；

(3)以工程菌為產酶菌株，使用發酵罐培養，利用乳糖誘導產酶后收集細胞：

(4)配制反應體系，經酶促反應得到利巴韋林轉化液；離心收集細胞后再進行下一批次的催化反應。

3.根據權利要求2所述的利用透性化細胞制備利巴韋林的方法，其特征在于：還包括步驟(5)對每一批次的轉化液進行檢測，計算利巴韋林的濃度以及反應轉化率。

4.根據權利要求2所述的利用透性化細胞制備利巴韋林的方法，其特征在于：所述步驟(1)中宿主菌Rosetta*的具體構建方法為：以Escherichia coli Rosetta(DE3)為出發菌，將溫敏型質粒pREDCas9轉化至出發菌感受態細胞中，質粒pREDCas9序列為序列表17所述序列；在擬操作基因位點yghXY查找20bp的靶序列和PAM位點，設計第一引物擴增靶序列并將其克隆到pGRB質粒上，pGRB質粒序列為序列表18所述序列，得到2個重組pGRB質粒，各所述第一引物序列為序列表4、5、6、7所述序列；以出發菌基因組為模板設計第二引物擴增得到待操作基因的上、下游片段，各所述上、下游片段序列為序列表8、14所述序列，各所述第二引物序列為序列表9、10、15、16所述序列；以嗜熱單孢菌Thermobifida fusca基因組為模板設計第三引物擴增得到受T7啟動子控制的角質酶基因片段P_T7-Tfu，所述片段P_T7-Tfu序列為序列表11所示序列，各所述第三引物序列為序列表12、13所示序列；以上、下游片段、P_T7-Tfu片段為模板，使用引物9和引物16進行重疊PCR獲得重疊片段。將重疊片段和重組pGRB質粒一起轉化含有pREDCas9質粒的出發菌感受態細胞；消除用于基因編輯的pREDCas9質粒以及重組pGRB質粒。

5.根據權利要求2所述的利用透性化細胞制備利巴韋林的方法，其特征在于：所述步驟(2)中工程菌Rosetta*/pET-His-pupG的構建方法為：以Bacillus subtilis 168的基因組為模板設計包括酶切位點及保護堿基的引物并擴增表達嘌呤核苷磷酸化酶基因pupG，所述嘌呤核苷磷酸化酶基因pupG序列為序列表1所示序列，所述擴增引物序列為序列表2、3所示序列；將質粒pET-His和擴增片段分別經限制性內切酶BamH I和Nhe I雙酶切，純化回收后轉化Escherichia coli DH5α感受態細胞；提取陽性菌中的pET-His-pupG質粒轉化宿主菌Rosetta*感受態細胞。

6.根據權利要求2所述的利用透性化細胞制備利巴韋林的方法，其特征在于：所述步驟(3)中工程菌的培養方法與誘導產酶方法為：將工程菌接種到斜面培養基中，37℃培養12-14h；無菌條件下吸取無菌水于3-5支活化斜面，使用無菌水將菌體重懸后接入含有發酵培養基的發酵罐中，通氣量2-4L/min，攪拌轉速200-500r/min，通過自動流加氨水控制pH在7.0-7.2，培養溫度35-37℃，培養至OD600＝12-14時，離心收集菌體。