[發明專利]一種高靈敏的突變位點檢測體系、方法及應用

有效

• 申請號: 201810347109.0
• 申請日: 2018-04-18
• 公開（公告）號: CN108642153B
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: 劉兆成;趙國棟
• 申請（專利權）人: 蘇州唯善生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 薛海霞;董建林

本發明公開了一種高靈敏的基因突變檢測體系、方法及應用，包括：設計針對野生型基因的野生型上游或下游引物、針對突變型基因的突變型上游或下游引物、通用的上游或下游引物、突變型blocker和野生型blocker；采用雙管PCR體系進行PCR反應，對樣本進行定量PCR檢測；其中，一管包括野生型引物、突變型blocker和通用引物，另一管包括突變型引物、野生型blocker和通用引物。本發明的高靈敏的基因突變檢測方法，通過特異性引物合并特異性blocker的方法，提高了檢測的特異性和靈敏度；本發明通過標準品以及標準曲線的繪制，很好的避免了假陽性和假陰性結果；本發明具有檢測萬分之一及其以上基因突變的能力。

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，特別涉及一種高靈敏的基因突變檢測體系、方法和應用。

背景技術

基因突變是指基因在結構上發生堿基對組成或排列順序的改變，如單核苷酸多態性(SNPs)以及未甲基化的核苷酸被轉化后堿基的變化。

單核苷酸多態性即SNPs是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A，G，C，T)替換而引起的多態性，是新一代多態性遺傳標記。 SNPs在生物基因組中廣泛存在，如人類30億個堿基中每千個堿基出現一次，在整個基因組共有300萬以上的SNPs。SNPs和疾病的發生發展密切相關。

細胞基因的甲基化和腫瘤的發生、發展密切相關，非甲基化的胞嘧啶(C)在亞硫酸氫鹽作用下轉化為尿嘧啶(U)，從而成為具有檢測價值的突變位點。

目前市面上針對基因突變檢測的方法有許多，包括一代測序、二代測序，基因芯片、熒光定量PCR(qPCR)技術等。但是在較高的野生型模板的背景下，針對稀有的基因突變的檢測能力有限。

稀有基因突變，指的是存在大量野生基因序列背景中的極為稀少的基因序列。在癌癥病人或是治療后病人血液中含有少量的腫瘤突變 DNA(ct-DNA)以及含有甲基化位點的DNA；孕婦外周血含有少量的胎兒DNA等，這些情況都屬于大量野生型背景下的稀有基因檢測。許多引起腫瘤的體細胞突變都是摻雜在野生型細胞內的，所提的 DNA也是帶有大量野生型DNA，同樣需要采用稀有基因突變的檢測方法。因此，稀有基因突變的檢測在癌癥篩查和預后跟蹤、無創產前篩查等具有十分重要的意義。

和測序技術檢測基因突變相比，qPCR技術具有迅速、方便、價格低等優點，可以做到對基因突變的高靈敏檢測。評價基因突變檢測方法的優劣包括：靈敏度、特異性、簡便程度等。靈敏度是指在大量野生型DNA背景下能夠檢測到的最小突變型的量；特異性是指不被檢測到的最大突變型的量?；赑CR技術的稀有基因突變檢測方法可以歸為兩類：(1)特異性引物擴增方法；(2)非特異性引物加特異性blockers的方法.第一類的特異性引物擴增的方法有ARMS (amplification refractory mutation system),ASB-PCR(allele-specificblocker PCR),以及castPCR(competitive allele specific TaqMan PCR)。第二類方法包括PNA blocker PCR和COLD-PCR(co-amplification at lower denaturationtemperature PCR)等.以上的方法具有高靈敏檢測基因突變的能力，但是需要堿基的修飾、特殊的反應試劑或特殊的反應程序等，因此有必要研發一種簡單的、靈敏度更高的檢測方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術中的不足，提供一種高靈敏的基因突變檢測體系、方法及應用。