[發(fā)明專利]一種快速鑒定生殖冷凍用玻璃化液的方法及其裝置

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810346534.8
• 申請(qǐng)日: 2018-04-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108469420B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 嚴(yán)杰;喬杰;李蓉;劉平;鄭曉英;黃錦;莊新杰;李軍生;林勝利;袁一峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)第三醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N21/31
• 分類號(hào): G01N21/31
• 代理公司: 北京超凡志成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11371
• 代理人: 王闖

本發(fā)明涉及一種快速鑒定生殖冷凍用玻璃化液的方法及其裝置。本發(fā)明所述方法包括以下步驟：取待測(cè)溶液置于?70～?90℃中冷凍處理5～10s，觀察經(jīng)冷凍處理后所述溶液呈現(xiàn)的外觀和流動(dòng)狀態(tài)，判斷所述溶液是否為生殖冷凍用玻璃化液；如果所述溶液經(jīng)冷凍后表現(xiàn)為透明的流動(dòng)狀態(tài)，則所述溶液屬于生殖冷凍用玻璃化液；如果所述溶液經(jīng)冷凍后呈現(xiàn)為白色且不流動(dòng)，則所述溶液不屬于生殖冷凍用玻璃化液。與常規(guī)檢測(cè)方法相比，本發(fā)明所述方法具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短以及在生殖冷凍前即能實(shí)施檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，可避免由于試劑的原因?qū)е律忱鋬鍪?，減少不必要的損失。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生殖冷凍領(lǐng)域，具體而言，涉及一種快速鑒定生殖冷凍用玻璃化液的方法及其裝置。

背景技術(shù)

生殖冷凍保存是指通過(guò)特殊的保護(hù)措施和降溫程序，使生殖細(xì)胞和胚胎等在-196℃條件下停止代謝，而升溫后又回復(fù)代謝能力的技術(shù)。隨著體外受精-胚胎移植及其衍生技術(shù)的不斷發(fā)展，涉及生殖細(xì)胞和胚胎的生殖冷凍保存技術(shù)已經(jīng)成為人類輔助生殖領(lǐng)域或動(dòng)物育種領(lǐng)域中必不可少的組成部分。

目前，常規(guī)的生殖冷凍技術(shù)包括慢速冷凍法和玻璃化冷凍法。

其中，慢速冷凍法是大多數(shù)哺乳動(dòng)物生殖冷凍保存的主要方法。該方法選擇較低濃度的滲透性防凍劑，采用緩慢降溫和快速解凍的方法來(lái)保存冷凍生殖。常規(guī)慢速冷凍法可以分為以下6個(gè)步驟：(1)室溫下生殖細(xì)胞或胚胎置于低分子量滲透性防凍液中5～10min，使生殖細(xì)胞/胚胎和冷凍液間達(dá)到平和；(2)在-5～-7℃植冰；(3)以0.2～2℃/min的速度緩慢降溫；(4)降溫到-30～-70℃，投入液氮中保存；(5)以250℃/min的速度快速解凍(例如25℃水中)；(6)在培養(yǎng)或移植前，室溫下除去防凍劑^[1]。

玻璃化冷凍是通過(guò)高濃度冷凍保護(hù)劑在冷凍過(guò)程中固化形成無(wú)結(jié)構(gòu)的玻璃樣物質(zhì)從而減少細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成以保護(hù)生殖的冷凍方法。所述無(wú)結(jié)構(gòu)的玻璃樣物質(zhì)的質(zhì)點(diǎn)不規(guī)則排列，能始終保持溶液的水分子和離子分布，使跨膜物質(zhì)的濃度和滲透壓差別不大，從而避免細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶對(duì)細(xì)胞的機(jī)械性損傷，也消除細(xì)胞外冰晶形成引起的理化損傷^[2]。與慢速低溫冷凍法相比，玻璃化冷凍法無(wú)需降溫儀精密控制降溫速度，僅需1分鐘即可完成，簡(jiǎn)化操作過(guò)程，大大縮短操作時(shí)間，同時(shí)對(duì)細(xì)胞的冷凍損傷更小。因此，玻璃化冷凍技術(shù)已經(jīng)成為生殖冷凍技術(shù)新方向。

在玻璃化冷凍過(guò)程中，生殖細(xì)胞和胚胎等需要嚴(yán)格按照順序依次經(jīng)歷至少2種液體，即冷凍用平衡液和冷凍用玻璃化液，經(jīng)充分浸泡、滲透、平衡，然后裝載至冷凍載桿上，并且直接投入液氮中，可實(shí)現(xiàn)快速降溫達(dá)到玻璃化狀態(tài)，從而避免冰晶結(jié)晶對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。如果經(jīng)歷液體的順序不對(duì)，就不能獲得玻璃化的狀態(tài)，那么在解凍復(fù)蘇時(shí)，生殖細(xì)胞和胚胎就會(huì)死亡。因此，嚴(yán)格的液體滲透順序和配方正確的試劑是保證玻璃化冷凍效果的基本條件。

但是，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，由于液體試劑種類繁多，配制復(fù)雜，會(huì)出現(xiàn)配置錯(cuò)誤的問(wèn)題。另外，在常溫下，平衡液和玻璃化液都呈現(xiàn)為粘稠的透明液體狀，二者呈現(xiàn)的外觀過(guò)于相似，容易混淆。無(wú)論是將玻璃化液配制錯(cuò)誤，例如，遺漏加入某種成分，還是將玻璃化液與其他溶液，例如平衡液混淆，都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。稍有不慎，就會(huì)導(dǎo)致該批次的生殖細(xì)胞或胚胎全部損傷死亡，對(duì)患者、醫(yī)院造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是嚴(yán)重的醫(yī)療事件，影響醫(yī)患關(guān)系。

因此，如何及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，采取必要措施，防患于未然，具有十分重要的意義。

目前，發(fā)現(xiàn)這一問(wèn)題的現(xiàn)有方法主要是通過(guò)冷凍保存后解凍復(fù)蘇時(shí)觀察生殖細(xì)胞或胚胎存活情況并結(jié)合經(jīng)驗(yàn)來(lái)鑒定?，F(xiàn)有的鑒定方法存在以下缺點(diǎn)：

1、發(fā)現(xiàn)過(guò)程的耗時(shí)周期長(zhǎng)，往往是經(jīng)歷了冷凍、保存后，在患者需要解凍生殖細(xì)胞或胚胎移植時(shí)才出現(xiàn)不良的后果，至少1個(gè)月以后才有可能引起操作者的注意。

2、發(fā)現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，往往受累生殖細(xì)胞或胚胎的數(shù)量已經(jīng)很大，會(huì)出現(xiàn)胚胎大量死亡，大范圍影響患者利益。