[發(fā)明專利]一種刺激隱核蟲局部感染斜帶石斑魚鰓組織的免疫模型構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810346051.8
• 申請(qǐng)日: 2018-04-09
• 公開（公告）號(hào): CN108293925B
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李言偉;但學(xué)明;莫澤權(quán)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A01K61/10
• 分類號(hào): A01K61/10
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本發(fā)明首次采用刺激隱核蟲局部感染斜帶石斑魚單側(cè)鰓的方式來進(jìn)行免疫，采用最優(yōu)化的感染濃度和感染時(shí)長，首次構(gòu)建了刺激隱核蟲局部感染斜帶石斑魚鰓組織的免疫模型，徹底消除了魚類局部鰓組織黏膜免疫應(yīng)答過程中“先天性差異”所帶來的負(fù)面影響，為研究局部黏膜免疫應(yīng)答規(guī)律提供了理想的免疫模型。本發(fā)明免疫模型的構(gòu)建方法主要包括5個(gè)歩驟：(1)刺激隱核蟲活幼蟲的收集和濃度計(jì)算；(2)斜帶石斑魚的分組和馴養(yǎng)；(3)局部鰓組織免疫；(4)感染強(qiáng)度的測定；(5)局部感染后魚體的處理。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于魚類免疫領(lǐng)域，具體為魚類黏膜免疫方向，具體涉及一種誘導(dǎo)斜帶石斑魚鰓組織局部黏膜免疫的免疫模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans)是一種原生纖毛蟲，可感染幾乎所有海水硬骨魚類引起嚴(yán)重的致死性疾病——刺激隱核蟲病或稱白點(diǎn)病(Colorni A and BurgessP.，1997)。刺激隱核蟲的生活史包括滋養(yǎng)體、包囊前體、包囊和幼蟲等4個(gè)階段，其中只有滋養(yǎng)體營專性寄生生活，以宿主體液、組織碎片以及完整細(xì)胞等為食。近年來，由于我國海水養(yǎng)殖的超負(fù)荷發(fā)展，養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，刺激隱核蟲病已經(jīng)成為大范圍、經(jīng)常性爆發(fā)的烈性傳染病，給海水漁業(yè)造成了非常嚴(yán)重的危害。2008年，農(nóng)業(yè)部將刺激隱核蟲病列入我國“二類動(dòng)物疫病”名錄，是我國“一、二類動(dòng)物疫病”名錄中唯一一種水產(chǎn)寄生蟲病，可見其危害的嚴(yán)重性。

不同于病毒、細(xì)菌等其他微生物病原的全身感染，刺激隱核蟲主要寄生于宿主的皮膚、鰭條和鰓上，其獨(dú)特的寄生性質(zhì)使其成為研究海水魚類局部皮膚和鰓黏膜免疫應(yīng)答的良好模型；此外，雖然刺激隱核蟲不能在體外培養(yǎng)，但我們建立了以卵形鯧鲹為宿主的刺激隱核蟲活體傳代方法和低溫保種方法，使我們可以隨時(shí)獲得大量的蟲體進(jìn)行人工定量感染實(shí)驗(yàn)，這是絕大多數(shù)水產(chǎn)寄生蟲所做不到的(Dan et al.，2006；Dan et al.，2009)。

目前，關(guān)于刺激隱核蟲感染誘導(dǎo)的宿主局部黏膜免疫應(yīng)答的研究，主要是通過刺激隱核蟲全身體表感染宿主魚模型進(jìn)行的(Yambot et al.，2006；Luo et al.，2007；但學(xué)明等，2008；Misumi，et al.，2011，2012)。此種方法感染后，魚的皮膚、鰓和鰭條全部同時(shí)被感染，再通過比對(duì)感染組與非感染組不同個(gè)體魚之間黏膜免疫應(yīng)答的差異，揭示宿主抗刺激隱核蟲感染的局部黏膜應(yīng)答規(guī)律。然而，由于魚類不同個(gè)體之間存在遺傳差異，比較不同個(gè)體之間免疫應(yīng)答的差異存在“先天性缺陷”。近期，有研究人員將石斑魚泄殖孔以下部分浸入到刺激隱核蟲的蟲液中，進(jìn)行局部尾部感染，再采集感染部位的皮膚和同一條魚未感染的皮膚，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，比較同一尾魚身上感染部位與非感染部位皮膚黏膜免疫應(yīng)答的差異(Hu et al.，2017)。該方法排除了不同個(gè)體遺傳背景的差異，相較于比較不同個(gè)體之間的差異已有很大改進(jìn)。但該方法不能排除同一尾魚尾部和尾部以外皮膚正常情況下免疫應(yīng)答的差異。基于此，本發(fā)明建立了一種刺激隱核蟲感染魚體單側(cè)鰓的模型，可供比較同一尾魚左右兩側(cè)感染與未感染鰓局部免疫應(yīng)答的差異，使結(jié)果更加精準(zhǔn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在克服海水魚在刺激隱核蟲免疫后個(gè)體差異所產(chǎn)生的影響，通過在同一尾魚的單側(cè)鰓實(shí)施局部黏膜免疫，為研究局部黏膜免疫應(yīng)答提供穩(wěn)定、可靠的實(shí)驗(yàn)材料。

本發(fā)明采用獨(dú)特的感染方式，培育出僅有單側(cè)鰓局部組織完成免疫的海水魚。

本發(fā)明的獨(dú)特之處在于，首次采用局部感染單側(cè)鰓的方式來進(jìn)行免疫，采用最優(yōu)化的感染濃度和感染時(shí)長，首次構(gòu)建了刺激隱核蟲局部感染斜帶石斑魚鰓的免疫模型，徹底消除了魚類局部組織黏膜免疫應(yīng)答過程中“先天性差異”所帶來的負(fù)面影響，為研究局部黏膜免疫應(yīng)答規(guī)律提供了理想的免疫模型。此外，還可以對(duì)同一鰓局部組織進(jìn)行多次的免疫以生產(chǎn)出局部多次免疫魚體，方便后續(xù)免疫記憶的研究。

本發(fā)明的優(yōu)勢在于，解決了在研究魚類黏膜免疫過程中，魚類個(gè)體差異或者組織差異產(chǎn)生的影響，并為研究魚類局部黏膜免疫應(yīng)答提供理想的實(shí)驗(yàn)材料和免疫模型。