[發(fā)明專利]一種刺激隱核蟲局部感染斜帶石斑魚鰓組織的免疫模型構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810346051.8
• 申請(qǐng)日: 2018-04-09
• 公開（公告）號(hào): CN108293925B
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李言偉;但學(xué)明;莫澤權(quán)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A01K61/10
• 分類號(hào): A01K61/10
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• 代理人: 暫無信息

1.一種刺激隱核蟲局部感染斜帶石斑魚鰓組織的免疫模型構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)刺激隱核蟲活幼蟲的收集和濃度計(jì)算

利用專門的刺激隱核蟲傳代系統(tǒng)對(duì)刺激隱核蟲進(jìn)行傳代和收集，其傳代宿主為卵形鯧鲹；采集發(fā)育良好的刺激隱核蟲包囊，置于消過毒的干凈燒杯中孵化，孵化用水為高壓滅菌的、加入適量青霉素和鏈霉素的自然海水；收集孵出2小時(shí)內(nèi)的刺激隱核蟲幼蟲蟲液，充分混勻后取50μL，加10μL甲醛將幼蟲殺死，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算出幼蟲蟲液的蟲體濃度；

(2)斜帶石斑魚的分組和馴養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用魚為20g左右的斜帶石斑魚；將斜帶石斑魚分為9組，包括實(shí)驗(yàn)組8個(gè)、對(duì)照組1個(gè)，每組15尾魚；魚體馴養(yǎng)2周，直至其進(jìn)食、活動(dòng)正常；整個(gè)養(yǎng)殖過程中，海水經(jīng)600目的濾網(wǎng)過濾，鹽度30‰左右，pH8左右，溶氧量在5.6mg/L以上；

(3)局部鰓組織免疫

實(shí)驗(yàn)組用剛孵出2小時(shí)內(nèi)不同濃度的刺激隱核蟲幼蟲進(jìn)行局部感染，實(shí)驗(yàn)組設(shè)4個(gè)幼蟲感染濃度：1000、5000、10000、15000個(gè)/ml，以及兩個(gè)感染時(shí)間：30s和60s；

具體感染過程如下：將斜帶石斑魚置入含1ppm丁香酚的海水中進(jìn)行麻醉，完全麻醉后取出并用含2ppm聚維酮碘海水沖洗鰓部組織；將魚體左側(cè)朝下平放于一濕毛巾上面，用手固定魚體頭部并用手指撐開左鰓蓋使鰓部組織完全暴露；設(shè)置計(jì)時(shí)器為30s或60s，取一帶刻度的一次性膠頭滴管吸取總量為1ml的蟲液，按下計(jì)時(shí)器并開始往左側(cè)鰓部組織小心滴入蟲液，在15s內(nèi)滴加完，保持鰓蓋張開至計(jì)時(shí)器響起后，將魚體兩側(cè)鰓蓋張開并用無蟲水沖洗10s，再將魚體轉(zhuǎn)移至新鮮海水中正常養(yǎng)殖；

對(duì)照組用0個(gè)幼蟲/ml的海水進(jìn)行感染，感染時(shí)間為60s，操作同上；

(4)感染強(qiáng)度的測定

感染48小時(shí)后，各組取5尾魚進(jìn)行麻醉，獲取左右兩側(cè)的所有鰓組織置于盛有海水的培養(yǎng)皿中，于顯微鏡下計(jì)數(shù)左右兩側(cè)刺激隱核蟲的滋養(yǎng)體數(shù)量，結(jié)果以均值表示；根據(jù)測定的各組感染強(qiáng)度結(jié)果，獲取最合適的感染濃度和感染時(shí)間，保證較高的刺激隱核蟲感染強(qiáng)度同時(shí)對(duì)魚體的存活不造成影響；最合適的感染濃度和感染時(shí)間為10000個(gè)/ml的蟲液感染60s；

(5)局部感染后魚體的處理

為避免重復(fù)感染，于刺激隱核蟲感染后每2天將魚體轉(zhuǎn)移到干凈的養(yǎng)殖缸內(nèi)，輪換養(yǎng)殖3次后，置于干凈養(yǎng)殖缸中正常養(yǎng)殖，獲取感染濃度和感染時(shí)間為10000個(gè)/ml、60s的實(shí)驗(yàn)組斜帶石斑魚，即獲得刺激隱核蟲局部感染斜帶石斑魚鰓組織的免疫模型；

移除魚體后的養(yǎng)殖缸，加入30cm深的淡水，浸泡8小時(shí)，即可殺滅所有粘附于缸底的刺激隱核蟲包囊，刷洗后排凈淡水。