[發明專利]一種生殖冷凍用玻璃化冷凍試劑、試劑盒及其使用方法

有效

• 申請號: 201810344477.X
• 申請日: 2018-04-17
• 公開（公告）號: CN108244102B
• 公開（公告）日: 2019-02-26
• 發明（設計）人: 嚴杰;喬杰;李蓉;劉平;鄭曉英;黃錦;莊新杰;李軍生;林勝利;袁一峰
• 申請（專利權）人: 北京大學第三醫院
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 王闖

本發明涉及一種生殖冷凍用玻璃化冷凍試劑、試劑盒及其使用方法。本發明所述生殖冷凍用玻璃化冷凍試劑包括細胞內玻璃化冷凍試劑，所述細胞內玻璃化冷凍試劑包括跨膜載體和包裹在所述跨膜載體中的冷凍保護劑，所述冷凍保護劑選自糖類冷凍保護劑、糖醇類冷凍化保護劑或胺類冷凍保護劑，因此，本發明所述玻璃化冷凍試劑能夠在避免細胞內形成冰晶同時，還極大地降低冷凍保護劑對細胞的毒性，提升細胞的存活率，保障細胞的正常發育。

技術領域

本發明涉及生殖冷凍領域，具體而言，涉及一種生殖冷凍用玻璃化冷凍試劑、試劑盒及其使用方法。

背景技術

生殖冷凍保存是指通過特殊的保護措施和降溫程序，使生殖細胞和胚胎等在-196℃條件下停止代謝，而升溫后又回復代謝能力的技術。隨著體外受精-胚胎移植及其衍生技術的不斷發展，涉及生殖細胞和胚胎的生殖冷凍保存技術已經成為人類輔助生殖領域或動物育種領域中必不可少的組成部分。

目前，常規的生殖冷凍技術包括慢速冷凍法和玻璃化冷凍法。

其中，慢速冷凍法是大多數哺乳動物生殖冷凍保存的主要方法。該方法選擇較低濃度的滲透性防凍劑，采用緩慢降溫和快速解凍的方法來保存冷凍生殖。常規慢速冷凍法可以分為以下6個步驟：(1)室溫下生殖細胞或胚胎置于低分子量滲透性防凍液中5～10min，使生殖細胞/胚胎和冷凍液間達到平和；(2)在-5～-7℃植冰；(3)以0.2～2℃/min的速度緩慢降溫；(4)降溫到-30～-70℃，投入液氮中保存；(5)以250℃/min的速度快速解凍(例如25℃水中)；(6)在培養或移植前，室溫下除去防凍劑^[1]。

玻璃化冷凍是通過高濃度冷凍保護劑在冷凍過程中固化形成無結構的玻璃樣物質從而減少細胞內外冰晶的形成以保護生殖的冷凍方法。所述無結構的玻璃樣物質的質點不規則排列，能始終保持溶液的水分子和離子分布，使跨膜物質的濃度和滲透壓差別不大，從而避免細胞內產生冰晶對細胞的機械性損傷，也消除細胞外冰晶形成引起的理化損傷^[2]。與慢速低溫冷凍法相比，玻璃化冷凍法無需降溫儀精密控制降溫速度，僅需1分鐘即可完成，簡化操作過程，大大縮短操作時間，同時玻璃化冷凍能大幅度提高生物樣品的冷凍速率，使生物樣品迅速穿過危險區溫區，同時減少冰晶對細胞骨架、膜完整性等的損傷，對細胞的冷凍損傷更小。因此，玻璃化冷凍技術已經成為生殖冷凍技術新方向。

而盡管玻璃化冷凍技術存在諸多優勢，已經成為發展趨勢之所在，但現有的玻璃化冷凍技術仍然存在一定的瓶頸，限制其推廣和應用，具體而言，主要表現在：

(1)玻璃化液需要加入高濃度的低溫保護劑以避免冷凍過程中冰晶的形成。一般而言，滲透性低溫保護劑濃度≥4M，非滲透性低溫保護劑濃度≥0.5M。而高濃度的低溫保護劑具有毒性，影響生殖細胞的質量以及胚胎的生長發育。例如，二甲基亞砜增加細胞外鈣離子向細胞內流動，造成細胞的潛在損害，影響細胞的分化和DNA的甲基化。而乙二醇濃度過高，則會影響細胞線粒體的功能。就目前的玻璃化冷凍效果而言，胚胎的發育率、臨床妊娠率和著床率難以達到令人滿意的水平。

(2)發生玻璃化轉變的生殖細胞或胚胎一直保存在液氮中，當需要恢復其活性時，必須復溫到環境溫度，但在復溫過程中，玻璃化細胞及其周邊冷凍保護液溶液容易卻極其容易再次形成冰晶，對細胞造成嚴重的損傷。

為解決上述技術問題，現有技術嘗試在生殖冷凍用玻璃化液中加入脯氨酸，以降低二甲基亞砜以及乙二醇等滲透型冷凍保護劑的使用，從而減少二甲基亞砜以及乙二醇等對細胞的毒害作用。但上述嘗試不能完全避免二甲基亞砜以及乙二醇的使用。CN104839144A雖然在玻璃化冷凍液中加入脯氨酸，但其仍需要加入5～15v/v％的二甲基亞砜以及乙二醇，因此，仍然對細胞具有一定的毒害作用。

其次，現有技術還嘗試在冷凍用玻璃化液中加入納米顆粒，依靠納米顆粒的高導熱性，在復溫過程中避免細胞內外再次結晶。但現有的納米顆粒，例如二氧化鈦納米顆粒等對細胞具有較強的毒性，影響細胞的存活率和發育率。