[發明專利]一種延長保存期的口蹄疫病毒cELISA抗體檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201810342072.2
• 申請日: 2018-04-17
• 公開（公告）號: CN110161237A
• 公開（公告）日: 2019-08-23
• 發明（設計）人: 苗海生;李樂;李華春;廖德芳;寇美玲
• 申請（專利權）人: 云南省畜牧獸醫科學院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/535
• 代理公司: 深圳龍圖騰專利代理有限公司 44541
• 代理人: 蔡瑞

本發明涉及一種通過保護固態口蹄疫病毒抗原而延長保存期的口蹄疫病毒cELISA抗體檢測試劑盒，先制備抗原保護劑：配制0.01M的PBS緩沖液作母液，依次加入10％BSA、10％的海藻糖、3％枸杞多糖、3％蘆薈多糖、0.01％硫柳汞、0.05％吐溫?20；充分混勻后經0.45nm孔徑濾膜過濾除菌，經無菌檢驗合格后方可使用；向制備好的口蹄疫病毒抗原固定板中加入抗原保護劑，可將酶標板內口蹄疫抗原穩定性保存期在4?6℃條件下延長至12個月，采用此酶標板制備的試劑盒比目前此類試劑盒的保存期長一倍，降低了養豬場購買試劑盒的成本，也減小了獸醫工作的管理強度。

技術領域

本發明屬于生物診斷檢測技術領域，具體涉及一種通過保護固態口蹄疫病毒抗原而延長保存期的口蹄疫病毒cELISA抗體檢測試劑盒。

背景技術

口蹄疫是重大動物疫病之一，世界動物衛生組織(OIE)將其歸為A類動物疫病之首?？谔阋卟《緦傩NA病毒科，口蹄疫病毒屬，共7個血清型，70多個亞型?？谔阋叩念A防和控制是世界性難題，全球每年因該病造成的直接經濟損失到數百億美元。每年我國投入數十億人民幣用于口蹄疫的防控和新技術研究，然而各地口蹄疫疫情仍然不斷出現。疫苗免疫是目前我國預防和控制口蹄疫疫情爆發和蔓延的主要手段，由于口蹄疫病毒抗原免疫原性較差，疫苗質量參差不齊，易感動物需多次接種疫苗才能達到理想的抗體水平，因此及時監測疫苗免疫后動物的抗體水平、評價免疫效果并采取相應的應對措施尤為重要。

OIE推薦的口蹄疫病毒結構蛋白抗體檢測方法為病毒中和試驗、液相阻斷酶聯免疫吸附試驗(LPB-ELISA)和固相競爭酶聯免疫吸附試驗(cELISA)(見OIE陸生動物診斷試驗與疫苗手冊，2012年第七版版，166-169頁)。cELISA檢測方法是OIE指定的國際貿易檢測方法，與LPB-ELISA檢測方法相比敏感性相同，但特異性更高。國外目前已有商品化口蹄疫的cELISA檢測試劑盒，其中有些cELISA檢測試劑盒應用的是表達抗原，由于表達抗原使用線狀氨基酸序列，可以實現直接固化在酶標板上，但不能覆蓋全病毒，存在抗原覆蓋面較窄等方面的問題，因此OIE不進行推薦使用。另一部分口蹄疫cELISA試劑盒是通過包被兔抗口蹄疫病毒抗體，然后捕獲口蹄疫病毒146S抗原(完整病毒顆粒抗原)，使抗原固定在酶標板上，封閉液封閉后用于抗體檢測。但是口蹄疫病毒抗原易于變性，在pH8.0以上、pH6.5以下會很快失活，對溫度也極為敏感，由于其它試劑的相對穩定，所以口蹄疫病毒抗原的穩定性是影響試劑盒的保存期的最主要因素，而目前此類口蹄疫cELISA試劑盒的在4-6℃條件下的保存期僅為6個月，成本較高，且對養豬場的獸醫跟蹤管理要求較高。因此，如果能保護口蹄疫病毒抗原在酶標板上的穩定性，就可以延長保存期，對于口蹄疫抗體的檢測來說是一項重要的技術進步。

中國農業科學院蘭州獸醫研究所王永祿等發明的口蹄疫抗原保存技術(申請號02124649.1)用于液態口蹄疫抗原保存，截至目前國內無用于口蹄疫cELISA固態抗原的專門保護劑及相應試劑盒。

發明內容

為解決上述問題，本發明提出一種延長保存期的口蹄疫病毒cELISA抗體檢測試劑盒。

本發明的延長保存期的口蹄疫病毒cELISA抗體檢測試劑盒，通過如下步驟制備而成：

1)制備抗原保護劑：配制0.01M的PBS緩沖液作母液，依次加入10％BSA、10％的海藻糖、3％枸杞多糖、3％蘆薈多糖、0.01％硫柳汞、0.05％吐溫-20；充分混勻后經0.45nm孔徑濾膜過濾除菌，經無菌檢驗合格后方可使用；

2)制備口蹄疫病毒抗原固定板：將兔抗口蹄疫病毒抗體用pH9.6的包被液稀釋，50μl/孔加入到96孔酶標板內，4℃靜置16小時；倒掉包被液，用0.01M的PBST洗滌3遍；每孔加入口蹄疫病毒抗原懸液50μl，37℃反應1小時；倒掉液體，用0.01MPBST洗滌3遍，即為口蹄疫病毒抗原固定板；