[發明專利]一種Wnt/β-catenin信號通路影響斑馬魚側線毛細胞再生的方法

有效

• 申請號: 201810338829.0
• 申請日: 2018-04-16
• 公開（公告）號: CN108524936B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 羋肖肖
• 申請（專利權）人: 杭州師范大學
• 主分類號: A61K45/00
• 分類號: A61K45/00;A61K31/18;A61P27/16;C12Q1/6888;C12Q1/686;G01N15/00;G01N15/10;G01N15/14
• 代理公司: 昆明合眾智信知識產權事務所 53113
• 代理人: 錢磊

1.一種Wnt/β-catenin信號通路影響斑馬魚側線毛細胞再生的方法，其特征在于：所述方法通過流式細胞分選斑馬魚側線神經丘助細胞、熒光定量PCR、整胚原位雜交以及外源添加Wnt/β-catenin信號通路小分子化合物抑制劑和增強劑的方法，觀察順鉑誘導毛細胞損傷過程中Wnt/β-catenin信號通路各因子的時空表達情況及毛細胞再生情況變化，對模式動物斑馬魚側線毛細胞再生進行影響，所述順鉑濃度為1mM，所述流式細胞分選斑馬魚側線神經丘助細胞方法具體為：收集5天轉基因魚SqET10順鉑處理3小時的樣本，冰上麻醉后，用刀片切除耳泡以前的頭部組織，將軀干組織轉移到無鈣Ringer’s溶液中，以5min為間隔用200μL槍頭上下吹打樣本15min以去除卵黃，將去除卵黃的樣本轉移至含有1mM EDTA0.25％Trypsin溶液中，28.5℃處理20～30min，其間每隔5min用1mL槍頭來回吹吸，幫助組織解散成單細胞懸液，加入10％FBS和1mM CaCl₂終止酶促分解反應，收集細胞懸液，1000rpm離心5min，1 x PBS清洗2次，最后重懸于500μL PBS溶液中，用BD Aria II流式細胞分選儀分選GFP陽性細胞，細胞接收液為PBS(1x)，將分選所得的溶液離心，1000rpm，5min，去除上清后，直接加入Trizol-80℃保存；所述頭部組織需要去除頭部側線組織；所述無鈣Ringer’s溶液配方為116mM Nacl+2.9mM Kcl+5mM pH7.2HEPES；所述熒光定量PCR方法為Trizol提取分選細胞總RNA，用M-MLV第一鏈合成體系逆轉成cDNA模板，β-actin為內參基因；所述QPCR所用的試劑盒為Green Quantitative RT-qPCR Kit；所述毛細胞再生的計數方法為10～15條斑馬魚幼魚放于1.5mL EP管中，加入500μL 2μM YO-PRO1毛細胞特異性活體染料，室溫避光30min，回收染料，用新鮮的養魚水潤洗幼魚3次即可，用0.016％質量體積比麻醉劑麻醉后，在Zeiss Axio A1倒置熒光顯微鏡計數側線神經丘毛細胞數。

2.根據權利要求1所述的Wnt/β-catenin信號通路影響斑馬魚側線毛細胞再生的方法，其特征在于：所述整胚原位雜交方法為取10條斑馬魚樣本，4％PFA固定過夜，加入地高辛標記的反義鏈探針孵育過夜保證探針充分結合，第二天加入堿性磷酸酶偶聯二抗室溫孵育4-5小時，后加入BCIP和NBT底物避光顯色。