[發(fā)明專利]一種檢測(cè)BRAFV600E基因突變的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810336729.4
• 申請(qǐng)日: 2018-04-16
• 公開（公告）號(hào): CN108277260A
• 公開（公告）日: 2018-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟憲瑛;魏佳;王瑤琪;陳光;張強(qiáng);孫旭;逄仁柱;楊帥;李勇;王培松
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6837
• 分類號(hào): C12Q1/6837
• 代理公司: 長(zhǎng)春眾邦菁華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 22214
• 代理人: 李外

一種檢測(cè)BRAFV600E基因突變的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。解決現(xiàn)有檢測(cè)BRAFV600E基因突變的方法操作繁雜，無法確定突變堿基，難于微型化和高通量的問題。該方法采用DNA微陣列技術(shù)，固定基因探針，與突變基因片段雜交后形成二聚體，再以帶有熒光染料CY5的DNA互補(bǔ)鏈為標(biāo)記物，通過雜交反應(yīng)標(biāo)記生物芯片，結(jié)合微陣列熒光掃描儀，獲得生物芯片上熒光染料的熒光信號(hào)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)BRAFV600E基因突變的定向檢測(cè)。本方法簡(jiǎn)便，靈敏度可達(dá)到0.1nM，可檢測(cè)BRAFV600E基因單核苷酸突變，突變基因的檢測(cè)限為：0.1nM，等位基因頻率低至0.1％，檢測(cè)范圍為：3個(gè)數(shù)量級(jí)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)BRAFV600E基因突變的方法。

背景技術(shù)

BRAF基因(v-raf鼠類肉瘤濾過性病毒致癌基因同源體B1)定位在7號(hào)染色體上，編碼BRAF激酶，在多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有突變，其中BRAFV600E位點(diǎn)的單基因突變常發(fā)生在甲狀腺乳頭狀癌中。它與腫瘤的中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵襲性密切相關(guān)，對(duì)于BRAF V600E進(jìn)行基因檢測(cè)有助于臨床醫(yī)生判斷術(shù)中是否需要預(yù)防性清掃頸部淋巴結(jié)。現(xiàn)常用的BRAFV600E的方法包括Sanger測(cè)序法、熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、免疫組化技術(shù)(IHC)等。Sanger測(cè)序法的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確性較高可檢測(cè)已知和未知突變，但是靈敏度較低(只有在突變率達(dá)到50％以上是才可檢測(cè)到)成本較高，耗時(shí)長(zhǎng)。RT-PCR檢測(cè)較為精準(zhǔn)，當(dāng)前使用較多，但其成本高、空間及人員要求高且只能檢測(cè)已知突變。免疫組化法用特異性抗體VE1識(shí)別V600E突變蛋白，在蛋白水平上推測(cè)BRAFV600E基因突變，具有較好的靈敏度和特異度，但無法精確檢測(cè)突變堿基并且只能檢測(cè)已知突變。近年來，核酸探針作為基因探針的一種，具有很強(qiáng)的親和力和選擇性，被廣泛應(yīng)用于生化分析中。

生物芯片是目前基因組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要工具，具有高通量，并對(duì)檢測(cè)樣品消耗量少等優(yōu)點(diǎn)(基因生物學(xué)，Genome Biol.2001，2，research0004.1～0004.13)，由于基因探針分子與靶分子的結(jié)合具有高靈敏度、高特異性的特點(diǎn)，因此將核酸探針、BRAFV600E突變基因的特異性識(shí)別與生物芯片結(jié)合在一起的技術(shù)還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有檢測(cè)BRAFV600E基因突變的方法操作繁雜，樣品消耗量大，難于微型化及低通量的問題，而提供一種檢測(cè)BRAFV600E基因突變的方法。

本發(fā)明提供一種檢測(cè)BRAFV600E基因突變的方法，包括以下步驟：

步驟一：將兩種BRAFV600E基因探針與點(diǎn)樣液混合得到兩種BRAFV600E基因探針點(diǎn)樣溶液，然后在基片上進(jìn)行點(diǎn)樣，得到BRAFV600E捕獲基因芯片；

步驟二：將細(xì)胞或組織中提取的DNA進(jìn)行兩步不對(duì)稱PCR反應(yīng)，得到單鏈待檢測(cè)目的基因；

步驟三：將步驟一得到的BRAFV600E捕獲基因芯片上的基因探針與步驟二得到的待檢測(cè)基因的目的基因片段或純突變型待檢測(cè)目的基因片段進(jìn)行雜交反應(yīng)，得到基因探針-目的基因二聚體生物芯片；

步驟四：將步驟三得到的基因探針-目的基因二聚體生物芯片與CY5標(biāo)記的DNA互補(bǔ)鏈雜交溶液進(jìn)行雜交反應(yīng)，得到熒光標(biāo)記的BRAFV600E生物芯片；

步驟五：將步驟四得到的熒光標(biāo)記的BRAFV600E生物芯片放入微陣列掃描儀中進(jìn)行檢測(cè)，得到BRAFV600E生物芯片的熒光檢測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)BRAFV600E基因突變的檢測(cè)。

優(yōu)選的是，所述的兩種BRAFV600E基因探針為突變型和野生型。

優(yōu)選的是，所述的步驟一中的BRAFV600E基因探針的濃度為10～50μM。

優(yōu)選的是，所述的步驟一中的基因探針為3’-NH₂修飾的DNA探針。