[發(fā)明專利]一種檢測BRAFV600E基因突變的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810336729.4 | 申請日： | 2018-04-16 |
| 公開（公告）號： | CN108277260A | 公開（公告）日： | 2018-07-13 |
| 發(fā)明（設計）人： | 孟憲瑛;魏佳;王瑤琪;陳光;張強;孫旭;逄仁柱;楊帥;李勇;王培松 | 申請（專利權(quán)）人： | 吉林大學 |
| 主分類號： | C12Q1/6837 | 分類號： | C12Q1/6837 |
| 代理公司： | 長春眾邦菁華知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 22214 | 代理人： | 李外 |
| 地址： | 130000 吉*** | 國省代碼： | 吉林;22 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 基因突變 生物芯片 突變基因 熒光染料 種檢測 檢測 單核苷酸突變 等位基因頻率 生物技術(shù)領域 微型化 熒光掃描儀 定向檢測 個數(shù)量級 固定基因 突變堿基 熒光信號 雜交反應 靈敏度 標記物 二聚體 高通量 可檢測 微陣列 探針 雜交 基因 | ||
1.一種檢測BRAFV600E基因突變的方法，其特征在于，包括以下步驟：
步驟一：將兩種BRAFV600E基因探針與點樣液混合得到兩種BRAFV600E基因探針點樣溶液，然后在基片上進行點樣，得到BRAFV600E捕獲基因芯片；
步驟二：將細胞或組織中提取的DNA進行兩步不對稱PCR反應，得到單鏈待檢測目的基因；
步驟三：將步驟一得到的BRAFV600E捕獲基因芯片上的基因探針與步驟二得到的待檢測基因的目的基因片段或純突變型待檢測目的基因片段進行雜交反應，得到基因探針-目的基因二聚體生物芯片；
步驟四：將步驟三得到的基因探針-目的基因二聚體生物芯片與CY5標記的DNA互補鏈雜交溶液進行雜交反應，得到熒光標記的BRAFV600E生物芯片；
步驟五：將步驟四得到的熒光標記的BRAFV600E生物芯片放入微陣列掃描儀中進行檢測，得到BRAFV600E生物芯片的熒光檢測信號，實現(xiàn)對BRAFV600E基因突變的檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測BRAFV600E基因突變的方法，其特征在于，所述的兩種BRAFV600E基因探針為突變型和野生型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測BRAFV600E基因突變的方法，其特征在于，所述的步驟一中的BRAFV600E基因探針的濃度為10～50μM。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測BRAFV600E基因突變的方法，其特征在于，所述的步驟一中的基因探針為3’-NH2修飾的DNA探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測BRAFV600E基因突變的方法，其特征在于，所述步驟二中的不對稱PCR兩步的條件均為：先在94℃下反應3分鐘；然后依次在94℃下反應30秒，47℃下反應20秒，68℃下反應20秒，30個循環(huán)；最后在68℃下反應5分鐘；4℃保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測BRAFV600E基因突變的方法，其特征在于，所述的步驟三具體為：
將待檢測基因的目的基因片段或純突變型待檢測目的基因片段放入雜交溶液中，得到待檢測基因的目的基因片段的雜交溶液或或純突變型待檢測目的基因片段雜交溶液，然后浸入沸水中加熱2min～3min，迅速加樣到BRAFV600E捕獲基因芯片上后放在40～47℃，25％～45％相對濕度的恒溫恒濕箱中，使BRAFV600E捕獲基因芯片上的BRAFV600E基因探針與待檢測基因的DNA互補鏈進行雜交反應，反應2小時，完畢后經(jīng)過洗滌，得到基因探針-目的基因二聚體生物芯片。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種檢測BRAFV600E基因突變的方法，其特征在于，所述的雜交溶液包括：質(zhì)量分數(shù)0.1％～0.2％的十二烷基硫酸鈉，pH＝7.0的含有0.4mol/L～0.5mol/L氯化鈉和40mmol/L～50mmol/L檸檬酸三鈉(二水)緩沖溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測BRAFV600E基因突變的方法，其特征在于，所述的待檢測基因的目的基因片段的雜交溶液中待檢測基因的目的基因片段的濃度為0.01nM～100nM。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測BRAFV600E基因突變的方法，其特征在于，所述的步驟四的雜交反應是在溫度為30℃，相對濕度為25％～45％的恒溫恒濕箱中進行。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測BRAFV600E基因突變的方法，其特征在于，所述的步驟四中CY5標記的DNA互補鏈雜交溶液是將CY5標記的DNA互補鏈放入雜交溶液中得到的，所述的CY5標記的DNA互補鏈的濃度為0.1μM～0.2μM。
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