[發明專利]一種快速高效的PPCs細胞培養方法

在審

• 申請號: 201810333226.1
• 申請日: 2018-04-13
• 公開（公告）號: CN108531452A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 王曉冰
• 申請（專利權）人: 上海錦映生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種快速高效的PPCs細胞培養方法，包括以下步驟：步驟1：使用明膠稀釋液過夜包被培養容器；步驟2：分離單個核細胞，然后洗滌、離心和重懸后分裝備用；分離單個核細胞的洗滌和重懸過程，使用成纖維細胞的細胞上清液進行；步驟3：將所述步驟1處理的培養容器內的多余明膠吸除，并將步驟2中獲得的單個核細胞接種到培養容器中，放置于氧濃度為0.5％?7％的細胞培養箱中培養。培養細胞所使用的培養基中一半體積為成纖維細胞的細胞上清液，另一半體積為包含有10ng/ml SCF等的DMEM/F12培養基。本發明的培養方法對人體損傷較小，可以多次實施，同時分離得到的PPCs細胞活率高、增殖快。

技術領域

本發明涉及細胞培養領域，尤其涉及一種快速高效的PPCs細胞培養方法。

背景技術

可編程的多能細胞(Programmable Pluripotent Cells,PPCs)是一種通過現代細胞技術和分子生物學技術，開發成功的一種來源于外周血單核細胞，經過誘導和逆轉，具有多能細胞特性的細胞。這種細胞的前身是外周血的單核細胞，經過特殊的去分化和擴增技術，使其生長為具有多能細胞的再生功能的新型細胞，然后回輸體內，可以對組織結構和功能進行再生和修復，另外，還可以激活組織器官內處于休眠或抑制狀態的前體細胞，取代并修復體內因病變而受損和失去功能的組織細胞，重新恢復建立重要生命器官的生理功能，以達到治療各種慢性疾病和抗衰老及保健的目的。

目前，PPCs的建立是基于德國Fandrich教授的技術。該技術存在許多缺陷，例如：1.一次性抽血量達500ml左右，對個體的影響比較大；2.培養基的選擇更傾向于淋巴細胞的培養，而非類干細胞的培養；3.培養基內添加了動物成份的血清。

發明內容

本發明為解決現有技術中的上述問題提出的提供一種區別于傳統培養法的人PPCs細胞的培養方法，低氧環境和成纖維細胞上清液使得PPCs細胞純度高，生長良好，細胞增殖快，細胞得率和存活率均大大提高同時能夠盡可能地避免動物成分對細胞培養的影響，為多能細胞的培養提供一種新的思路和方法。

為了實現上述技術目的，本發明所采取的技術措施為：

一種快速高效的PPCs細胞培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1：使用0.1％的明膠稀釋液37℃培養箱中過夜包被培養容器；

步驟2：分離單個核細胞，然后洗滌、離心并重懸；分離單個核細胞的洗滌和重懸過程，使用成纖維細胞的細胞上清液進行，優選使用成纖維細胞培養3天后的細胞上清液；

步驟3：將所述步驟1處理的培養容器內的明膠吸除，并將步驟2獲得的單個核細胞接種到培養容器中，放置在氧濃度為0.5％-7％的細胞培養箱中培養。

為了進一步優化上述技術方案，本發明所采取的技術措施還包括：

優選地，步驟3中的培養容器中的氧濃度為5％；

優選地，培養細胞所使用的培養基中一半體積為成纖維細胞的細胞上清液，另一半體積為包含有5-12％knockout血清替代品、0.5％雙抗、0.007ul/ml b-巰基乙醇、10ng/ml SCF以及100U/ml IL-3的DMEM/F12培養基。

優選地，上述成纖維細胞的細胞上清液，是將成纖維細胞培養3天后的上清液用0.22μm濾膜過濾后獲得。

優選地，上述成纖維細胞以4×10⁶/瓶接種于T75瓶中，培養基為10％knockout血清替代品的DMEM/F12培養基，在37℃下，放置于5％CO₂的培養箱中培養。

優選地，上述培養容器為細胞培養瓶或細胞培養板。