[發(fā)明專利]一種ESCRT-III核心亞基Snf7類雙鏈RNA及其制備方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810332093.6
• 申請日: 2018-04-13
• 公開（公告）號: CN108707603B
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張文慶;黎丹
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;A01N57/16;A01P7/04
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務(wù)所有限公司 44100
• 代理人: 劉婉

1.一種干擾Snf7基因表達的ESCRT-III核心亞基Snf7類雙鏈RNA，其特征在于，其轉(zhuǎn)錄模板的正義鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.權(quán)利要求1所述的ESCRT-III核心亞基Snf7類雙鏈RNA的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1)提取褐飛虱總RNA：取成蟲，于液氮中研磨，用TRIzol法提取總RNA；

2)合成cDNA第一鏈：將1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；

3)制備褐飛虱Snf7同源基因Nl020727基因中間片段，并制備含有所述中間片段的載體；

4)以步驟3)得到的載體為模板，擴增得到目的片段，即所述ESCRT-III核心亞基Snf7類雙鏈RNA；

所述步驟3)的具體操作如下：

步驟1、聚合酶鏈式反應(yīng)：試劑包括cDNA 1.5μL、10μM的所述Nl020727基因特異性上游引物Nl020727-F 2μL、10μM的所述Nl020727基因特異性下游引物Nl020727-R 2μL、2×Phanta Max Buffer 25μL、dNTP mix 1μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Ploymerase1μL、雙蒸水17.5μL；將所述試劑混合得到混合液，總體積為50μL；所述聚合酶鏈式反應(yīng)的具體步驟如下：將所述混合液95℃預(yù)變性3min，然后進入下列循環(huán)：95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，共30個循環(huán)，最后72℃再延伸7min；其中，擴增所述Nl020727基因特異性片段的上游引物Nl020727-F的序列為：5’-CCCTTTCACTACTACTCATCTTCA-3’；下游引物Nl020727-R的序列為：5’-GTTCTTCTTCTTCTTTTTCTTCCT-3’；

步驟2、擴增產(chǎn)物純化：使用Magen凝膠回收試劑盒純化PCR擴增片段，得到純化產(chǎn)物；

步驟3、中間載體獲得：將所述純化產(chǎn)物按照連接反應(yīng)體系，克隆到pEASY-Blunt Zero載體，轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細胞，在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上過夜培養(yǎng)，得到菌落；所述連接反應(yīng)體系為：純化產(chǎn)物4μL，pEASY-Blunt Zero 1μL，總體積共5μL；

步驟4、質(zhì)粒純化：將所述菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床過夜培養(yǎng)后收取菌液，抽提質(zhì)粒，得到含有Nl020727基因的質(zhì)粒pEASY—020727；

所述步驟4)的具體操作如下：

步驟a、設(shè)計以下特異性引物：

dsNl020727-F：5’-AATGAAGGGAAGAGAGATCGTGCCAAA-3’

dsNl020727-R：5’-TACAGCCTCATCATCCTCAGCAGTCA-3’

dsNl020727-T7F：

5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGAATGAAGGGAAGAGAGATCGTGCCAAA-3’

dsNl020727-T7R：

5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTACAGCCTCATCATCCTCAGCAGTCA -3’

步驟b、以所述含有Nl020727基因的質(zhì)粒為模板，使用所述步驟a中的特異性引物分別按照以下反應(yīng)條件擴增，得到目的片段：

A反應(yīng)體系如下：

B反應(yīng)體系如下：

PCR儀擴增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸35s，30個循環(huán)；72℃再延伸10min；

其中，通過dsRNA合成試劑盒合成所述Nl020727基因?qū)?yīng)的雙鏈RNA。

3.權(quán)利要求1所述的ESCRT-III核心亞基Snf7類雙鏈RNA在制備用于防治褐飛虱的藥物中的應(yīng)用。

4.一種防治褐飛虱的方法，其特征在于：使用權(quán)利要求1所述的ESCRT-III核心亞基Snf7類雙鏈RNA對褐飛虱進行注射。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：注射所述ESCRT-III核心亞基Snf7類雙鏈RNA的終濃度為0.025μg/μL至0.2μg/μL。

6.一種防治褐飛虱殺蟲劑，其特征在于包括權(quán)利要求1所述的ESCRT-III核心亞基Snf7類雙鏈RNA作為活性成分。