[發明專利]一種基于DHAV-1 3A蛋白的間接ELISA檢測方法及應用

在審

• 申請號: 201810331738.4
• 申請日: 2018-04-13
• 公開（公告）號: CN108828223A
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發明（設計）人: 程安春;汪銘書;張盛勇
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

本發明公開了一種基于DHAV?1 3A蛋白的間接ELISA檢測方法及應用。該檢測方法中涉及一種試劑盒，所述試劑盒以3A?198重組蛋白為包被抗原，所述3A?198重組蛋白為去掉DHAV?1 3A基因跨膜區的3A截短基因編碼的重組融合蛋白。本發明的檢測方法有著重復性和特異性好，檢測的靈敏度高的優點，與基于DHAV?1病毒的間接ELISA方法符合率高，可用于DHAV?1抗體的檢測。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體地說，涉及一種基于DHAV-1 3A蛋白的間接ELISA檢測方法及應用。

背景技術

鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是由鴨肝炎病毒(Duck hepatitisvirus，DHV)引起的主要針對雛鴨的一種高度致死性病毒傳染病。其中分布最廣危害最大的為1型鴨甲肝病毒(DHAV-1)。

1型鴨甲肝病毒屬小RNA病毒科(Picornaviridae)，該病毒核衣殼為對稱的二十面體，無囊膜，核心為單股正鏈RNA，大小為20-40nm。1型鴨甲肝病毒能耐受pH3.0的環境，對高溫也有較強的耐受力。病毒能夠在自然環境中存活37d，-20℃條件下則可以存活數年。該病毒可在鴨胚和鵝胚的絨毛尿囊腔內增殖。I型鴨肝炎在自然狀態下僅發生于雛鴨，成年種鴨不發病，且不影響其產蛋率。人工感染DHAV-1后其他禽類也有一定反應，其中以雛雉、鵝和珍珠雞等感染后死亡率較高。Reuss研究表明，該病并不能傳播給兔、豚鼠、小白鼠和犬。該病可以接觸傳播，傳播效率高，可以通過鼠作為貯存宿主。并且可以通過鳥類帶毒遠程傳播。該病發生無明顯的季節性，一年四季均可發生，雛鴨的發病率為100％，1周齡雛鴨的病死率可達95％，而1-3周齡雛鴨病死率為50％或更低，4-5周齡雛鴨的發病率和病死率都很低。

針對于DHAV的檢測目前我國還沒有被批準的商業化檢測試劑盒。傳統的ELISA檢測方法需要使用大量的DHAV病毒粒子，而病毒粒子的純化需要借助高轉速離心機，且所得病毒純度很難保證，這就給商業化試劑盒的研發進程極大的限制。目前雖然有對于1型鴨甲肝病毒的研究報道，但對于其各蛋白亞基，尤其是對非結構蛋白研究甚少，對3A的研究未見報道。

發明內容

有鑒于此，本發明針對上述的問題，提供了一種基于DHAV-1 3A蛋白的間接ELISA檢測方法及應用。

為了解決上述技術問題，本發明公開了一種基于DHAV-1 3A蛋白的間接ELISA檢測試劑盒，所述試劑盒以3A-198重組蛋白為包被抗原，所述3A-198重組蛋白為去掉DHAV-1 3A基因跨膜區的3A截短基因編碼的重組融合蛋白。

進一步地，所述去掉DHAV-1 3A基因跨膜區的3A截短基因編碼的重組融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。

進一步地，所述3A-198重組蛋白通過以下方法制備得到：通過PCR獲得去掉3A基因跨膜區的3A截短基因片段，將目的片段亞克隆至pET-32a(+)，構建重組質粒pET-32-3A-198；將重組質粒轉化入表達菌BL21(DE3)后誘導表達為31kD的3A截短重組融合蛋白，命名為3A-198；以0.1mmol/LIPTG、37℃誘導6h獲得最大表達量，蛋白均表達于上清，采用Ni親和層析柱法純化3A-198，制備得到3A-198重組蛋白。

進一步地，所述試劑盒中包被抗原的包被濃度為6.185μg/mL。

進一步地，所述試劑盒包括封閉液，所述封閉液為含5％BSA的PBS。

進一步地，所述試劑盒還包括酶標二抗，所述酶標二抗為HRP標記的抗鴨IgG，酶標二抗的稀釋度為1:2000。

本發明還提供一種基于DHAV-1 3A蛋白的間接ELISA檢測方法，包括以下步驟：