[發明專利]一種基于DHAV-1 3A蛋白的間接ELISA檢測方法及應用

在審

• 申請號: 201810331738.4
• 申請日: 2018-04-13
• 公開（公告）號: CN108828223A
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發明（設計）人: 程安春;汪銘書;張盛勇
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

1.一種基于DHAV-1 3A蛋白的間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒以3A-198重組蛋白為包被抗原，所述3A-198重組蛋白為去掉DHAV-1 3A基因跨膜區的3A截短基因編碼的重組融合蛋白。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述去掉DHAV-1 3A基因跨膜區的3A截短基因編碼的重組融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述3A-198重組蛋白通過以下方法制備得到：通過PCR獲得去掉3A基因跨膜區的3A截短基因片段，將目的片段亞克隆至pET-32a(+)，構建重組質粒pET-32-3A-198；將重組質粒轉化入表達菌BL21(DE3)后誘導表達為31kD的3A截短重組融合蛋白，命名為3A-198；以0.1mmol/L IPTG、37℃誘導6h獲得最大表達量，蛋白均表達于上清，采用Ni親和層析柱法純化3A-198，制備得到3A-198重組蛋白。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包被抗原的包被濃度為6.185μg/mL。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括封閉液，所述封閉液為含5％BSA的PBS。

6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括酶標二抗，所述酶標二抗為HRP標記的抗鴨IgG，酶標二抗的稀釋度為1:2000。

7.一種基于DHAV-1 3A蛋白的間接ELISA檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)包被抗原：將權利要求3制備得到的3A-198重組蛋白作為抗原使用0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋后加入酶標板，每孔加入100μL，4℃包被過夜；抗原的包被濃度為6.185μg/mL；

(2)洗滌酶標板：棄去包被液，使用含0.05％吐溫20、pH7.4的PBS洗滌3次，5min/次，甩干殘留液體；

(3)封閉：向酶標板中加入封閉液，每孔100μL，37℃孵育；其中，封閉液為含5％BSA的PBS；

(4)洗滌酶標板：如步驟(2)方法洗滌；

(5)孵育一抗：加入稀釋后的鴨血清，每孔100μL，37℃孵育；鴨血清的稀釋度為1:20；

(6)洗滌酶標板：如步驟(2)方法洗滌；

(7)酶標二抗：加入稀釋后的HRP標記的抗鴨IgG，每孔100μL，37℃孵育；HRP標記的抗鴨IgG為兔抗鴨IgG，稀釋度為1:2000；

(8)洗滌酶標板：如步驟(2)方法洗滌；

(9)顯色：加入TMB顯色液，每孔100μL，37℃避光反應10min；

(10)終止：加入2mol/L H₂SO₄終止反應，每孔100μL；

(11)讀數：使用酶標儀在450nm和630nm雙波下測定OD值。

8.根據權利要求7所述的基于3A-198重組蛋白的間接ELISA檢測方法，其特征在于，步驟(3)中的孵育時間為90min。

9.根據權利要求7所述的基于3A-198重組蛋白的間接ELISA檢測方法，其特征在于，步驟(5)和步驟(7)中的孵育時間均為30min。

10.權利要求1-5任一所述的試劑盒在檢測DHAV血清抗體中的應用。