[發(fā)明專利]一種高效NK細(xì)胞培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810331464.9
• 申請日: 2018-04-13
• 公開（公告）號: CN108504636A
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王曉冰
• 申請（專利權(quán)）人: 上海錦映生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/078;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種高效NK細(xì)胞培養(yǎng)方法，本發(fā)明的培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)的NK細(xì)胞的數(shù)量足，擴(kuò)增快，一般外周血培養(yǎng)15天，能夠達(dá)到70億個細(xì)胞；本發(fā)明通過培養(yǎng)基中添加乙?；疗暇厶亲鳛榧せ钫{(diào)動劑，成功激活了NK細(xì)胞，促使其分泌IL2、IL12和IFN?γ，而IL2、IL12和IFN?γ在NK細(xì)胞活化后維持其活性和擴(kuò)增速率起到關(guān)鍵的作用，使其更具有臨床應(yīng)用價值；此外，本發(fā)明方法獲得NK細(xì)胞的純度高，對流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CD3^?CD56⁺的NK細(xì)胞數(shù)達(dá)到80％以上，滿足臨床應(yīng)用的要求。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種高效NK細(xì)胞培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，主要分布于外周血中，占PBMC的5％-10％，淋巴結(jié)和骨髓中也有NK活性，但水平較外周血低。NK細(xì)胞是一群異質(zhì)性、多功能的免疫細(xì)胞，是人類的眾多免疫細(xì)胞中的一種，表現(xiàn)為自然細(xì)胞毒活性的殺傷細(xì)胞。主要作用消滅攻擊人類身體的病毒、細(xì)菌、癌細(xì)胞等。發(fā)揮作用的方式分為：直接殺傷、釋放穿孔素、NK細(xì)胞毒因子和TNF等。每個人的身體里至少有50億個NK細(xì)胞，多則達(dá)到1000億個。但NK細(xì)胞的數(shù)量和其活動力不是成正比的。即使NK細(xì)胞顯示有足夠的數(shù)量，但是不激活他們，他們的工作效率也是非常低的。

目前，國內(nèi)外已經(jīng)有大量的研究者進(jìn)行了人NK細(xì)胞的培養(yǎng)和生物治療方面的研究，但多數(shù)研究都是單純利用IL-2和IL-12等白介素類細(xì)胞因子去培養(yǎng)，但是這樣獲得的結(jié)果往往有兩個弊端，要么是數(shù)量上不去，達(dá)不到治療性回輸所需的量，要么是純度上不去，達(dá)不到應(yīng)有的效果。因為白介素類細(xì)胞因子都不是強(qiáng)烈的NK細(xì)胞活化劑，缺乏強(qiáng)有力的活化作用。但是，當(dāng)NK細(xì)胞被充分活化后，白介素類細(xì)胞因子對NK細(xì)胞的活性維持和增殖發(fā)揮了極為重要的作用。因此，獲得高數(shù)量高純度的NK細(xì)胞，首先需要充分活化NK細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題提供一種區(qū)別于傳統(tǒng)培養(yǎng)法的人NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，使之簡單易行。本發(fā)明中培養(yǎng)獲得的人NK細(xì)胞被活化，NK細(xì)胞分泌的IL2、IL12和IFN-γ的表達(dá)水平更高，細(xì)胞純度高，生長良好，細(xì)胞增殖更快，且細(xì)胞得率和存活率均大大提高。

為了實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施為：

一種高效NK細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

步驟1：用PBS稀釋單克隆抗體CD16和CD2獲得抗體稀釋液，然后用抗體稀釋液過夜包被細(xì)胞培養(yǎng)容器；

步驟2：分離單個核細(xì)胞；

步驟3：將步驟2獲得的單個核細(xì)胞接種到培養(yǎng)容器中，從接種時間開始計時，每隔3天更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)18天后收集細(xì)胞；所述的細(xì)胞培養(yǎng)基中含有乙?；疗暇厶?。

為了優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：

優(yōu)選地，上述的乙?；疗暇厶菨舛葹?-15mg/ml。

優(yōu)選地，上述的細(xì)胞培養(yǎng)基，還含有10％knockout血清替代品和500U/ml的IL-2。

優(yōu)選地，上述的10％knockout血清替代品還可以替換成人血小板裂解物。

優(yōu)選地，上述的細(xì)胞培養(yǎng)基為CellGro SCGM或RPMI-1640培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，上述的培養(yǎng)容器為細(xì)胞培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)板，更優(yōu)選為T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

優(yōu)選地，上述步驟2的接種細(xì)胞密度為2×10⁶/ml。

另一方面，本發(fā)明還提供根據(jù)上述的細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的NK細(xì)胞及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。