[發明專利]基于CRISPR-鏈取代的等溫擴增及檢測技術

在審

• 申請號: 201810328785.3
• 申請日: 2018-04-13
• 公開（公告）號: CN108588182A
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發明（設計）人: 喻學鋒;周文華;胡麗
• 申請（專利權）人: 中國科學院深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 許飛

本發明公開了基于CRISPR?鏈取代的等溫擴增及檢測技術。基于CRISPR?鏈取代的等溫擴增試劑盒，包括鏈取代等溫擴增試劑，試劑盒還包括了野生型Cas9和/或核酸酶缺陷的Cas9切口酶、特異性識別目標DNA序列上下游的sgRNA對，鏈取代等溫擴增反應的擴增引物對，該引物對與Cas9?sgRNA復合體對與目的基因結合后暴露出的單鏈區域互補。該技術操作簡單，抗干擾能力強，檢測結果準確可靠。

技術領域

本發明涉及一種核酸擴增技術及基于該技術的檢測技術，特別涉及基于CRISPR-鏈取代的等溫擴增及檢測技術。

背景技術

核酸分子基于其生物特性被視為重要的生物標志物。核酸分子的檢測在醫學診療、食品安全、公共衛生和社會安全等方面有著廣泛的應用。通常，在核酸檢測過程中，待檢樣品中的靶核酸分子濃度極低，而非靶核酸分子濃度則較高。因此，對待檢測樣品中的靶核酸分子特異性擴增是提高核酸檢測反應的靈敏度和準確度的常用方法。

目前，通過PCR擴增技術特異性地擴增待檢測樣品中的靶核酸分子(DNA)片段是核酸檢測中使用的最主要的技術，也是目前最有效、最直接的方法。然而，PCR技術目前仍具有諸多難以克服的限制，例如：1)對模板DNA純度要求高；2)對反應條件敏感，而實際待檢測樣品中往往存在對PCR反應有抑制作用的成分；3)擴增反應需經歷多重變溫反應，反應時間較長；4)檢測反應所需設備及結果分析設備成本較高，只能在實驗室完成；以及5)檢測所需試劑成本高，且使用操作需經過專業培訓，相關檢測需耗費大量人力物力成本。同時，在醫學診療、食品安全相關的實際檢測中，需要開展實地檢測，并盡可能在短的時間內獲得靶核酸分子的檢測結果。因此，基于PCR技術的核酸檢測手段無法滿足實際應用的需求，新的低成本，高效快速的核酸檢測手段將因此具有廣泛的應用潛力。

針對上述問題，研究人員開發出了一系列核酸的等溫擴增技術(IsothermalAmplification)以解決PCR擴增技術中面臨的諸多問題。針對于DNA的檢測，通常利用具有鏈取代功能的聚合酶(如Klenow Fragment，Bst，等)，在有切口酶(如SDA技術)或無切口酶(如LAMP、RCA、HDA和RPA等技術)參與下，在1-2小時內將靶DNA的擴增至可被檢測的水平(Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNApolymerase system,Walker GT等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1992,89(1):392–396；Loop-mediated isothermal amplification of DNA,Notomi T等,Nucleic Acids Res.,2000,28(12):e63；Rolling replication of short DNA circles,Fire A等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1995,92(10):4641–4645；Helicase-dependent isothermalDNA amplification,Vincent M等,EMBO Rep.,2004,5(8):795–800；DNA detection usingrecombination proteins,Piepenburg O等,PLoS Biol.,2006,4(7):e204)。