[發明專利]一種熒光定量PCR技術檢測意大利蜜蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶PTS基因表達的方法

在審

• 申請號: 201810326195.7
• 申請日: 2018-04-12
• 公開（公告）號: CN108384839A
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發明（設計）人: 舒蕊
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院蠶桑研究所
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6876
• 代理公司: 合肥中博知信知識產權代理有限公司 34142
• 代理人: 錢衛佳

本發明公開了一種熒光定量PCR技術檢測意大利蜜蜂6?丙酮酰四氫蝶呤合酶PTS基因表達的方法，具體涉及生物技術領域，本發明中意大利蜜蜂PTS實時熒光RT?PCR檢測方法的建立，包括以下步驟：(1)使用引物進行基因的檢測和獲得；(2)總RNA的提??；(3)cDNA合成；(4)實時熒光PCR；(5)意大利蜜蜂工蜂、雄蜂和蜂王PTS基因的相對表達量計算；本發明采用的實時熒光RT?PCR與常規PCR相比，實時熒光PCR技術由自動化儀器收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，進一步提高靈敏度；實時熒光RT?PCR技術全封閉反應，無須PCR后處理，避免污染，保證結果的可靠性和重復性。同時，免除常規PCR中電泳、定量掃描等后續繁瑣步驟，大大縮短實驗時間。

技術領域：

本發明涉及生物技術領域，具體涉及用于檢測意大利蜜蜂PTS基因表達的特異性引物，一種熒光定量PCR技術檢測意大利蜜蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶PTS基因表達的方法。

背景技術：

蜜蜂作為重要的經濟昆蟲，廣泛分布于全世界，全世界蜂群的飼養量約7000萬群，在農作物授粉方面發揮著重要作用，具有極高的經濟和生態學價值。蜂產品，如蜂蜜、蜂王漿、蜂膠等，是維護人類健康不可多得的天然產品，創造了可觀的社會和經濟效益。

隨著2006年科學家公布了蜜蜂基因組的測序結果，蜜蜂成為了繼果蠅、按蚊、家蠶之后，第四種測定基因組序列的昆蟲，蜜蜂研究正式進入了“后基因組”時代。蜜蜂已經發展成為社會性昆蟲的模式生物，用以探究昆蟲社會性、神經生理與行為以及級型分化等。

級型分化是社會性昆蟲的一個典型特征。具有相同遺傳物質的二倍體蜜蜂幼蟲，在幼蟲期不同食物的影響下可分別發育成蜂王和工蜂，兩者在形態和社會職能上都有著顯著的區別。蜂群的三型蜂體色分化(圖1所示)是級型分化的一種表現，然而，關于蜜蜂體色分化的研究鮮有報道。黑色素、眼色素和蝶呤類色素是構成昆蟲體色及斑紋形成模式的三大內源性色素，西方蜜蜂體表的黃色較明顯，與黃色物質形成直接相關的是蝶呤類色素合成途徑，即BH₄合成途徑。

現階段BH₄的合成途徑在哺乳動物中的研究最多也最為詳細的。在高等哺乳動物體內，BH₄合成主要包括4個途徑：從頭合成途徑、補救合成途徑、重生途徑以及可選途徑。BH₄的從頭合成途徑研究較多、較為透徹。該途徑從鳥苷三磷酸(GTP)開始，先后在GTP環化酶(GTPCH)、6-丙酮酰四氫蝶呤合酶(PTS)和墨蝶呤還原酶(SPR)的催化作用下，最終生成BH₄。

PTS是催化BH₄從頭合成途徑中第二步反應的酶，它催化二氫新蝶呤三磷酸轉變為PTP，該反應依賴于Mg²⁺和Zn²⁺。在人類基因突變導致高苯丙氨酸血癥和神經遞質缺乏癥的病例中，基因PTS是第一個被發現的。目前，從約250名PTS缺乏癥患者體內分離發現了44個PTS基因突變的位點，其中，27個(約占67％)會導致患者出現嚴重的高苯丙氨酸血癥和神經遞質缺乏癥的病癥，剩下33％的患者只會出現一種病癥或兩種輕微的病癥。人類和哺乳動物的PTS基因結構是高度保守的，它們的基因組序列有6-7Kbp,包含了6個外顯子。發現的44個突變位點分布在該基因所有的6個外顯子和前面3個內含子的區域內。

除了大量的突變位點，不同物種的PTS基因表達與調控方式也有不同。比如，果蠅的PTS基因轉錄了兩種類型的PTS mRNA：一類是受近端啟動子作用的，只在頭部特異出現，具有3個外顯子的序列。另一類是受遠端啟動子作用的，在5’端非翻譯區多了一段新的內含子序列。但是這兩類mRNA在果蠅體內表達的ORF序列是一樣的。甚至，在人類基因組中發現了一個假PTS基因，稱為PTS-P1，位于9號染色體。PTS-P1cDNA與PTS cDNA的序列相似度為74％。迄今為止，還沒有哺乳動物PTS基因轉錄起始位點和相關啟動子的報道。