[發明專利]一種熒光定量PCR技術檢測意大利蜜蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶PTS基因表達的方法

在審

• 申請號: 201810326195.7
• 申請日: 2018-04-12
• 公開（公告）號: CN108384839A
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發明（設計）人: 舒蕊
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院蠶桑研究所
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6876
• 代理公司: 合肥中博知信知識產權代理有限公司 34142
• 代理人: 錢衛佳

1.一種熒光定量PCR技術檢測意大利蜜蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶PTS基因表達的方法，其特征在于，它是由符合熒光RT-PCR反應特點的特異性上下游引物，如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。

2.根據權利要求1所述的熒光定量PCR技術檢測意大利蜜蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶PTS基因表達的方法，其特征在于，按如下步驟進行：

使用下述引物進行該基因的檢測：

(1)符合熒光RT-PCR反應特點的該序列特異上下游引物，如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。

(2)總RNA的提取：采用一種通用的RNA提取方法，從意大利蜜蜂中提取總RNA；

(3)cDNA合成：以意大利蜜蜂總RNA為模板合成cDNA，反應體系為20μL；

(4)實時熒光PCR：以上述合成的cDNA為模板，上述(1)中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2及β-actin-F序列如(SEQ ID NO.6)和β-actin-R序列如(SEQ ID NO.7)為特異性引物，進行實時熒光PCR擴增反應，每個樣品設3個平行管，擴增后所得3個平行管的Ct值取平均數；

(5)意大利蜜蜂工蜂、雄蜂和蜂王PTS基因的相對表達量計算：實時熒光定量PCR后，當目的基因與內參基因的擴增效率相近時，采用2^－ΔΔCT法計算意大利蜜蜂工蜂、雄蜂和蜂王PTS基因的相對表達量。

3.根據權利要求1所述熒光定量PCR技術檢測意大利蜜蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶PTS基因表達的方法，其特征在于，其中每條引物分別配制成濃度為100μM的貯存液，工作濃度為2μM。

4.根據權利要求2所述熒光定量PCR技術檢測意大利蜜蜂6-丙酮酰四氫蝶呤合酶PTS基因表達的方法，其特征在于，實時熒光RT-PCR后，當目的基因與內參基因的擴增效率相近時，采用2^－ΔΔCT法計算PTS基因的相對表達量，且熒光定量PCR技術檢測意大利蜜蜂工蜂、雄蜂和蜂王PTS基因的表達水平有明顯差異。