[發(fā)明專利]一種乳品中金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810326130.2
• 申請(qǐng)日: 2018-04-12
• 公開（公告）號(hào): CN108517355A
• 公開（公告）日: 2018-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊洋;張若鴻;吳同磊;張志強(qiáng);劉素穩(wěn);胡鐵鋒;劉志飛;張瑩;許瑞;蔡金星;劉紹軍;李軍;張茜;陳妤昕;董文翔;張雨;張潔;李旭陽;周肖楠;鄭子欽;鄭亞超;張航;張瑞雪;陳雷;陳海藝;杜夏馨;管麗;李愷安;鄧雅晶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河北科技師范學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/686
• 分類號(hào): C12Q1/686;C12Q1/6806;C12Q1/14;C12R1/445
• 代理公司: 西安銘澤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61223
• 代理人: 俞曉明

本發(fā)明屬于食品致病菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種乳品中金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)方法，包括收集待測(cè)樣品，制成樣品溶液；乳制品前處理；制備納米氫氧化鈦/氫氧化鋯固定濾紙圓片；制備納米氫氧化鈦/氫氧化鋯固定濾紙圓片處理樣品；提取金黃色葡萄球菌DNA；PCR檢測(cè)。本發(fā)明針對(duì)金黃色葡萄球菌建立一種從乳品中靈敏快速實(shí)用性強(qiáng)無需前增菌的PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)間為4小時(shí)，且檢測(cè)限低，檢測(cè)靈敏度高，不容易出現(xiàn)假陽性或者假陰性結(jié)果，可以確保食品從農(nóng)場(chǎng)到餐桌流通過程中的食品安全實(shí)時(shí)檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食品致病菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種乳品中金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

近年來，全球食源性疾病發(fā)病率呈不斷上升的趨勢(shì)。據(jù)報(bào)道，發(fā)達(dá)國(guó)家每年約30％的人口患食源性疾病。盡管沒有關(guān)于發(fā)展中國(guó)家食源性疾病的系統(tǒng)性報(bào)道，但情況可能更嚴(yán)重。WHO報(bào)告表明，全球食源性疾病患者達(dá)數(shù)億人，每年約有幾億腹瀉病例，導(dǎo)致約300萬5歲以下兒童死亡，其中約70％是因生物源性污染食品所致。在發(fā)展中國(guó)家，估計(jì)每年腹瀉及其相關(guān)疾病有2.7億病例，導(dǎo)致240萬5歲以下兒童死亡,食源性疾病不但嚴(yán)重危害人們的健康，而且造成大量經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，全球每年發(fā)生40-60億例食源性疾病，發(fā)展中國(guó)家每年約有180萬人口死于食源性疾病，即使是在發(fā)達(dá)國(guó)家，每年亦有10％以上的人群感染食源性疾病。食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，食源性致病菌對(duì)人類健康造成極大危害，是食品安全的重大隱患。食源性疾病并不隨經(jīng)濟(jì)發(fā)展和技術(shù)進(jìn)步而減少或消失，世界范圍內(nèi)食品安全惡性事件接連發(fā)生，食源性疾病未能受到有效控制，食源性疾病發(fā)生率居高不下，食品安全形勢(shì)嚴(yán)峻。目前我國(guó)對(duì)于食源性病原菌的檢測(cè)、鑒定仍停留在分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生化鑒定和血清學(xué)分型水平，這些傳統(tǒng)的方法操作復(fù)雜、檢測(cè)周期較長(zhǎng)，而且無法對(duì)難以培養(yǎng)的病原菌進(jìn)行檢測(cè)；而一些簡(jiǎn)單的分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法假陽性或者假陰性率又較高，因此快速、簡(jiǎn)便、特異的檢測(cè)方法成為研究的熱點(diǎn)。

現(xiàn)有技術(shù)中，常用的食源性致病菌快速檢測(cè)方法簡(jiǎn)要介紹如下：

1.PCR技術(shù)：PCR技術(shù)是在1971年首先提出的。該方法通過對(duì)人工難以培養(yǎng)的微生物相應(yīng)DNA片段的擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物含量，從而快速地對(duì)食品中致病菌含量進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，首先在高溫下(95℃)使得蛋白質(zhì)變性，DNA雙鏈變成單鏈；再迅速降溫(55℃)，每條DNA單鏈退火，這就是所謂的熱循環(huán)。之后溫度重新上升到95℃，開始新的循環(huán)。經(jīng)一套擴(kuò)增循環(huán)(21到31次)將一個(gè)單分子DNA擴(kuò)增到10⁷分子。整個(gè)過程可以在1h內(nèi)通過自動(dòng)熱量循環(huán)器完成。理論上，只要樣品中含有一分子沙門氏菌的DNA，通過PCR技術(shù)完全可以在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到。這種測(cè)定方法的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定結(jié)果迅速，靈敏度和特異性高，檢測(cè)成本低。PCR技術(shù)采用DNA擴(kuò)增和自動(dòng)化程序?qū)μ囟ǖ闹虏【M(jìn)行檢測(cè)，己經(jīng)成功地對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、單核細(xì)胞李斯特菌等致病菌進(jìn)行了有效測(cè)定。

2.酶聯(lián)免疫法ELISA：抗原-抗體反應(yīng)法是測(cè)定特異性致病菌及其產(chǎn)生毒素最常用的方法。ELISA是利用抗原和抗體之間的反應(yīng)，在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的許多方面都有應(yīng)用。抗體在抗血清中可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。這兩種抗體在ELISA技術(shù)中對(duì)于沙門氏菌、大腸桿菌0157:H7、李斯特菌等血清型細(xì)菌有很好的檢測(cè)效果。

3.生物感應(yīng)器Biosensor：生物傳感器主要由生物識(shí)別元件和信號(hào)轉(zhuǎn)換器兩大部分組成。生物識(shí)別元件又稱感受器，由具有分子識(shí)別能力的生物活性物質(zhì)(如酶、微生物、動(dòng)植物組織切片)構(gòu)成。信號(hào)轉(zhuǎn)換器(如熱敏電阻、光纖等)是一個(gè)電化學(xué)、光學(xué)或熱敏檢測(cè)元件。當(dāng)生物識(shí)別元件與待測(cè)物發(fā)生特異作用后，所得產(chǎn)物(光、熱等)通過信號(hào)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成可以輸出的電信號(hào)、光信號(hào)等，從而達(dá)到分析檢測(cè)的目的。由于生物傳感器具有經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、專一性強(qiáng)等特點(diǎn)，在現(xiàn)代食品微生物檢測(cè)中前景廣闊。