[發明專利]一種乳品中金黃色葡萄球菌的快速檢測方法

在審

• 申請號: 201810326130.2
• 申請日: 2018-04-12
• 公開（公告）號: CN108517355A
• 公開（公告）日: 2018-09-11
• 發明（設計）人: 楊洋;張若鴻;吳同磊;張志強;劉素穩;胡鐵鋒;劉志飛;張瑩;許瑞;蔡金星;劉紹軍;李軍;張茜;陳妤昕;董文翔;張雨;張潔;李旭陽;周肖楠;鄭子欽;鄭亞超;張航;張瑞雪;陳雷;陳海藝;杜夏馨;管麗;李愷安;鄧雅晶
• 申請（專利權）人: 河北科技師范學院
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6806;C12Q1/14;C12R1/445
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 俞曉明

1.一種乳品中金黃色葡萄球菌的快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1，收集待測樣品，去脂肪，制成去脂肪樣品溶液；

S2，乳制品前處理

將無水乙醇、氨水和石油醚分別加入到樣品溶液中，混勻，得到的混合物離心，棄去上清液，將沉淀溶于10mmol/L的TE緩沖液中，得到去脂肪樣品溶液；其中，無水乙醇、氨水、石油醚、樣品溶液和TE緩沖液的體積比例為1：1：1：25：1；

S3，制備納米氫氧化鈦/氫氧化鋯固定濾紙圓片

將納米氫氧化鈦和納米氫氧化鋯按照1～5:1～5的質量比例混合后溶解在10g/100ml的SDS溶液中，且SDS溶液的溶劑為10mmol/L、pH＝7.8的TE緩沖液，溶質為SDS；除菌，得到無菌納米氫氧化鈦/氫氧化鋯溶液；制備濾紙圓片，滅菌，浸泡于無菌納米氫氧化鈦/氫氧化鋯溶液中，充分浸濕濾紙圓片，干燥，用超純水清洗濾紙圓片，再次干燥，得到納米氫氧化鈦/氫氧化鋯固定濾紙圓片；

S4，制備納米氫氧化鈦/氫氧化鋯固定濾紙圓片處理樣品

向去脂肪樣品溶液加入0.25倍體積的乙酸乙酯，混勻，離心，去掉上清液，沉淀用滅菌超純水懸浮，加入所述納米氫氧化鈦/氫氧化鋯固定濾紙圓片，充分浸濕，取出濾紙圓片干燥；將干燥的納米氫氧化鈦/氫氧化鋯固定的濾紙圓片浸入到滅菌的10g/100ml的SDS溶液中，攪拌，取出濾紙圓片并放入到10mmol/L、pH＝7.8的TE緩沖液中，攪拌，用無菌去離子水清洗濾紙圓片兩次；清洗過后的濾紙圓片再次干燥，得到金黃色葡萄球菌吸附濾紙；

S5，提取金黃色葡萄球菌DNA

將金黃色葡萄球菌吸附濾紙浸泡在含有牛血清白蛋白的蛋白溶液中，加入0.05mg/ml鮭魚精DNA溶液和去離子水；沸水浴，得到的細胞裂解物冰上冷卻至室溫，離心，取上清并加入等量體積4℃預冷的無水乙醇，離心，棄去上清液，保留沉淀的DNA，加入無菌去離子水溶解沉淀的DNA，得到DNA模板，備用；

S6，PCR檢測

PCR檢測使用的引物序列為：

nuc1：5’-gcagatttacgagatagaggaaca-3’

nuc2：5’-tttatgtggttatttcctgac-3’

如果獲得的PCR檢測產物片段為827bp，則結果為陽性。

2.根據權利要求1所述的乳品中金黃色葡萄球菌的快速檢測方法，其特征在于，S1的具體步驟為：如果待測乳品為生牛乳，則直接作為樣品溶液備用；如果待測乳品為乳粉，則將乳粉與滅菌超純水混合按照1g：1ml的比例混合均勻，至固體徹底溶解，得到均質液，作為樣品溶液備用；如果待測乳品為奶酪，則將奶酪磨碎，加入2g/100ml檸檬酸鈉溶液，混合均勻制成均質液，作為樣品溶液備用，其中奶酪與檸檬酸鈉溶液的比例為25g：90ml。

3.根據權利要求1所述的乳品中金黃色葡萄球菌的快速檢測方法，其特征在于，所述去脂肪的具體步驟如下：將無水乙醇、濃氨水和石油醚分別加入到待測樣品中，混勻，得到的混合物12000gpm離心5min，棄去上清液，將沉淀溶于10mmol/L、pH＝8的TE緩沖液中，得到去脂肪樣品溶液；其中無水乙醇、濃氨水、石油醚、待測樣品、TE緩沖液的體積比例為1：1：1：25：1。

4.根據權利要求1所述的乳品中金黃色葡萄球菌的快速檢測方法，其特征在于，S2中離心的條件為12000gpm離心5min，TE緩沖液的pH＝8。

5.根據權利要求1所述的乳品中金黃色葡萄球菌的快速檢測方法，其特征在于，S3中，納米氫氧化鈦的粒徑為100-200nm，納米氫氧化鋯的粒徑為50-100nm。