[發(fā)明專利]一種乳品中金黃色葡萄球菌的快速檢測方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810326130.2 | 申請日: | 2018-04-12 |
| 公開(公告)號: | CN108517355A | 公開(公告)日: | 2018-09-11 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人: | 楊洋;張若鴻;吳同磊;張志強;劉素穩(wěn);胡鐵鋒;劉志飛;張瑩;許瑞;蔡金星;劉紹軍;李軍;張茜;陳妤昕;董文翔;張雨;張潔;李旭陽;周肖楠;鄭子欽;鄭亞超;張航;張瑞雪;陳雷;陳海藝;杜夏馨;管麗;李愷安;鄧雅晶 | 申請(專利權(quán))人: | 河北科技師范學(xué)院 |
| 主分類號: | C12Q1/686 | 分類號: | C12Q1/686;C12Q1/6806;C12Q1/14;C12R1/445 |
| 代理公司: | 西安銘澤知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61223 | 代理人: | 俞曉明 |
| 地址: | 066604 河北省*** | 國省代碼: | 河北;13 |
| 權(quán)利要求書: | 查看更多 | 說明書: | 查看更多 |
| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 金黃色葡萄球菌 納米氫氧化鈦 固定濾紙 快速檢測 氫氧化鋯 圓片 制備 金黃色葡萄球菌DNA 檢測技術(shù)領(lǐng)域 假陰性結(jié)果 檢測靈敏度 食品致病菌 待測樣品 流通過程 食品安全 實時檢測 樣品溶液 假陽性 前處理 檢測 乳制品 增菌 靈敏 餐桌 農(nóng)場 | ||
1.一種乳品中金黃色葡萄球菌的快速檢測方法,其特征在于,包括以下步驟:
S1,收集待測樣品,去脂肪,制成去脂肪樣品溶液;
S2,乳制品前處理
將無水乙醇、氨水和石油醚分別加入到樣品溶液中,混勻,得到的混合物離心,棄去上清液,將沉淀溶于10mmol/L的TE緩沖液中,得到去脂肪樣品溶液;其中,無水乙醇、氨水、石油醚、樣品溶液和TE緩沖液的體積比例為1:1:1:25:1;
S3,制備納米氫氧化鈦/氫氧化鋯固定濾紙圓片
將納米氫氧化鈦和納米氫氧化鋯按照1~5:1~5的質(zhì)量比例混合后溶解在10g/100ml的SDS溶液中,且SDS溶液的溶劑為10mmol/L、pH=7.8的TE緩沖液,溶質(zhì)為SDS;除菌,得到無菌納米氫氧化鈦/氫氧化鋯溶液;制備濾紙圓片,滅菌,浸泡于無菌納米氫氧化鈦/氫氧化鋯溶液中,充分浸濕濾紙圓片,干燥,用超純水清洗濾紙圓片,再次干燥,得到納米氫氧化鈦/氫氧化鋯固定濾紙圓片;
S4,制備納米氫氧化鈦/氫氧化鋯固定濾紙圓片處理樣品
向去脂肪樣品溶液加入0.25倍體積的乙酸乙酯,混勻,離心,去掉上清液,沉淀用滅菌超純水懸浮,加入所述納米氫氧化鈦/氫氧化鋯固定濾紙圓片,充分浸濕,取出濾紙圓片干燥;將干燥的納米氫氧化鈦/氫氧化鋯固定的濾紙圓片浸入到滅菌的10g/100ml的SDS溶液中,攪拌,取出濾紙圓片并放入到10mmol/L、pH=7.8的TE緩沖液中,攪拌,用無菌去離子水清洗濾紙圓片兩次;清洗過后的濾紙圓片再次干燥,得到金黃色葡萄球菌吸附濾紙;
S5,提取金黃色葡萄球菌DNA
將金黃色葡萄球菌吸附濾紙浸泡在含有牛血清白蛋白的蛋白溶液中,加入0.05mg/ml鮭魚精DNA溶液和去離子水;沸水浴,得到的細胞裂解物冰上冷卻至室溫,離心,取上清并加入等量體積4℃預(yù)冷的無水乙醇,離心,棄去上清液,保留沉淀的DNA,加入無菌去離子水溶解沉淀的DNA,得到DNA模板,備用;
S6,PCR檢測
PCR檢測使用的引物序列為:
nuc1:5’-gcagatttacgagatagaggaaca-3’
nuc2:5’-tttatgtggttatttcctgac-3’
如果獲得的PCR檢測產(chǎn)物片段為827bp,則結(jié)果為陽性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳品中金黃色葡萄球菌的快速檢測方法,其特征在于,S1的具體步驟為:如果待測乳品為生牛乳,則直接作為樣品溶液備用;如果待測乳品為乳粉,則將乳粉與滅菌超純水混合按照1g:1ml的比例混合均勻,至固體徹底溶解,得到均質(zhì)液,作為樣品溶液備用;如果待測乳品為奶酪,則將奶酪磨碎,加入2g/100ml檸檬酸鈉溶液,混合均勻制成均質(zhì)液,作為樣品溶液備用,其中奶酪與檸檬酸鈉溶液的比例為25g:90ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳品中金黃色葡萄球菌的快速檢測方法,其特征在于,所述去脂肪的具體步驟如下:將無水乙醇、濃氨水和石油醚分別加入到待測樣品中,混勻,得到的混合物12000gpm離心5min,棄去上清液,將沉淀溶于10mmol/L、pH=8的TE緩沖液中,得到去脂肪樣品溶液;其中無水乙醇、濃氨水、石油醚、待測樣品、TE緩沖液的體積比例為1:1:1:25:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳品中金黃色葡萄球菌的快速檢測方法,其特征在于,S2中離心的條件為12000gpm離心5min,TE緩沖液的pH=8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳品中金黃色葡萄球菌的快速檢測方法,其特征在于,S3中,納米氫氧化鈦的粒徑為100-200nm,納米氫氧化鋯的粒徑為50-100nm。
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