[發(fā)明專利]培養(yǎng)基及其在中央記憶型T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810325698.2
• 申請日: 2018-04-12
• 公開（公告）號(hào): CN108486055B
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫忠杰;陳立功;郭瀟;薛慶磊;左慧晶;劉慶軍;馬駿凡
• 申請（專利權(quán)）人: 諾未科技（北京）有限公司;保定諾未科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0783
• 分類號(hào): C12N5/0783
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 溫可睿;趙青朵

本發(fā)明涉及干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及培養(yǎng)基及其在中央記憶型T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、mTOR抑制劑、白細(xì)胞介素?2、白細(xì)胞介素?7、白細(xì)胞介素?12、白細(xì)胞介素?15、白細(xì)胞介素?1a、Anti?CD3抗體和Anti?CD28抗體組成。本發(fā)明培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法可以提供高數(shù)量和比例的中央記憶型T淋巴細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)表明，使用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基可以擴(kuò)增TCM達(dá)約100倍，在培養(yǎng)的20天中，第20天細(xì)胞數(shù)量最多，而第12天(樣本B)TCM細(xì)胞的純度最高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及培養(yǎng)基及其在中央記憶型T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

免疫系統(tǒng)能夠幫助機(jī)體抵抗病菌感染和清除腫瘤，以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，其發(fā)揮作用的基礎(chǔ)在于免疫細(xì)胞。免疫細(xì)胞包括抗原遞呈細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等，在中樞免疫器官和外周免疫器官均有分布。中樞免疫器官一般指骨髓和胸腺，分別是B細(xì)胞和T細(xì)胞發(fā)育的場所；外周免疫器官一般指脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)等，是B細(xì)胞和T細(xì)胞駐守和巡視的場所。免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的紊亂會(huì)導(dǎo)致多種疾病的產(chǎn)生。免疫缺陷，如先天性重癥聯(lián)合免疫缺陷、HIV感染引發(fā)的T細(xì)胞死亡以及藥物處理導(dǎo)致免疫細(xì)胞的清除，均會(huì)大大增加機(jī)體機(jī)會(huì)感染的概率，嚴(yán)重者引發(fā)死亡。免疫機(jī)能亢進(jìn)則會(huì)引發(fā)自身免疫疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。因此，維持機(jī)體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)對于機(jī)體的正常生理功能和健康至關(guān)重要。

腫瘤細(xì)胞是一類惡性無限增殖的細(xì)胞，正常情況下會(huì)被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別并殺死。腫瘤細(xì)胞一般過量表達(dá)機(jī)體正常細(xì)胞不表達(dá)或者低表達(dá)的表面抗原，因而會(huì)被抗原遞呈細(xì)胞識(shí)別，并激活T細(xì)胞分化產(chǎn)生抗原特異性的效應(yīng)T細(xì)胞，效應(yīng)T細(xì)胞遷移至病灶處殺死腫瘤細(xì)胞。初次免疫反應(yīng)發(fā)生后，90-95％的效應(yīng)T細(xì)胞相繼死亡，剩下的細(xì)胞是中央記憶T細(xì)胞(Central Memory T Cell,TCM)和效應(yīng)記憶T細(xì)胞(Effector Memory Cell,TEM)，它們會(huì)在相同抗原的再次刺激下迅速增殖分化產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞，快速消滅腫瘤。

一般地，發(fā)揮殺瘤作用的細(xì)胞多為CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic TLymphocyte,CTL)，主要通過T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)與靶細(xì)胞的腫瘤抗原和HLAI型抗原相結(jié)合，成功捕捉靶細(xì)胞，然后通過兩種方式殺死靶細(xì)胞：一種方式是CTL分泌釋放細(xì)胞毒素，如穿孔素、顆粒酶以及顆粒酶溶解素等，細(xì)胞毒素進(jìn)入靶細(xì)胞胞質(zhì)后激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)靶細(xì)胞凋亡；另一種方式是通過CTL的表面配體FasL與靶細(xì)胞表面的Fas相結(jié)合，通過招募死亡誘導(dǎo)訊號(hào)復(fù)合體(Death Inducing Signal Complex,DISC)，誘發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)靶細(xì)胞凋亡。CD4+T細(xì)胞在腫瘤免疫中主要發(fā)揮輔助作用。CD4+T細(xì)胞經(jīng)靶細(xì)胞活化后，通過分泌TNFa,IFNγ等炎癥因子招募巨噬細(xì)胞侵入腫瘤病灶，幫助CTL殺傷腫瘤細(xì)胞，且對CD8+Tcm的形成不可或缺。

腫瘤細(xì)胞有多種方式逃避免疫監(jiān)視而逐步發(fā)展成為難以治愈的癌癥。首先，有些腫瘤細(xì)胞因?yàn)門AP或者B2M基因突變導(dǎo)致人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)表達(dá)量偏低或者消失，致使CTL不能有效辨別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞。另外，腫瘤細(xì)胞表達(dá)VISTA、TIM3、LAG3、PD-1等表面抗原，與CTL相應(yīng)受體結(jié)合后能夠激發(fā)免疫抑制效果，使CTL癱瘓，無法釋放細(xì)胞毒素。再者，腫瘤細(xì)胞分泌TGFb、CSF-1、adenosine等因子吸引或激活調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、二型巨噬細(xì)胞和髓系來源的抑制細(xì)胞(myeloid derived suppressive cells,MDSC)等，使CTL凋亡或衰竭。