[發明專利]一種積累幾丁寡糖重組枯草芽孢桿菌及其應用

在審

• 申請號: 201810325444.0
• 申請日: 2018-04-12
• 公開（公告）號: CN108531436A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 劉龍;堵國成;陳堅;凌美希;李江華;劉延峰
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P19/26;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種積累幾丁寡糖重組枯草芽孢桿菌及其應用，屬于遺傳工程領域。本發明是以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 168)作為表達宿主，通過過表達來源于百脈根根瘤菌(Mesorhizobium loti)的N?乙酰氨基葡萄糖糖基轉移酶編碼基因nodC，得到了積累幾丁寡糖枯草芽孢桿菌基因工程菌，產量達到136mg/L，其中，幾丁三糖、幾丁四糖和幾丁五糖的含量分別為8mg/L，28mg/L和100mg/L，為進一步代謝工程改造枯草芽孢桿菌生產幾丁寡糖奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及一種積累幾丁寡糖重組枯草芽孢桿菌及其應用，屬于遺傳工程領域。

背景技術

幾丁寡糖是由N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵連接起來的低聚合度水溶性甲殼低聚糖，是幾丁質經水解生成的一類低聚物。與幾丁質相比，幾丁寡糖具有更高的水溶性，很容易被吸收利用，它們不僅具有幾丁質的部分相似性質，而且一些功能性質更加顯著。據報道，幾丁寡糖具有抗菌活性、抗腫瘤活性、抵抗細菌侵染的防御能力、降低膽固醇的能力和促進鈣吸收的能力、促進雙歧桿菌增殖及強的吸濕保濕性能等性質，因此幾丁寡糖在食品、醫藥、農業、日化用品等領域均具有廣泛應用。目前，幾丁寡糖的合成主要通過化學降解法和酶降解法，但前者需利用強酸或者強氧化劑處理，環境污染較為嚴重，而后者需要利用蝦殼蟹殼為原料制備幾丁質底物，易引起過敏反應，不適宜海鮮過敏的人群服用。

微生物細胞中存在著可能是最大數量的天然糖供體，利用微生物進行寡糖的生物合成，可直接或間接的利用天然糖供體進行目的寡糖的規模合成，使得許多天然或非天然的功能性寡糖的應用成為可能。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營養化學品的生產宿主，其產品被FDA認證為“generally regarded assafe”(GRAS)安全級別。因此，運用代謝工程手段構建重組枯草芽孢桿菌是生產食品安全級幾丁寡糖的有效途徑。然而，枯草芽孢桿菌中氨糖代謝途徑調控嚴密，且沒有幾丁寡糖合成關鍵基因，并不會形成幾丁寡糖的積累。如何改造枯草芽孢桿菌中氨糖代謝途徑，供需前體物質，以及建立幾丁寡糖代謝途徑是一個值得深入探討的問題。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種積累幾丁寡糖的重組枯草芽孢桿菌，是將百脈根根瘤菌來源的N-乙酰氨基葡萄糖糖基轉移酶編碼基因(nodC)克隆到表達載體pP43NMK，然后轉化枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 168)，通過改造代謝途徑，實現幾丁寡糖的積累。

在本發明的一種實施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖糖基轉移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本發明的一種實施方式中，編碼所述N-乙酰氨基葡萄糖糖基轉移酶的基因如SEQ ID NO.2所示。

在本發明的一種實施方式中，采用載體pP43NMK表達N-乙酰氨基葡萄糖糖基轉移酶nodC。

本發明的第二個目的是提供一種構建上述重組枯草芽孢桿菌的構建方法，包括如下步驟：

1)構建重組質粒：克隆百脈根根瘤菌來源的N-乙酰氨基葡萄糖糖基轉移酶編碼基因nodC，連接到重組表達質粒上；

2)構建產幾丁寡糖重組枯草芽孢桿菌：將上述重組表達載體轉化枯草芽孢桿菌，得到產幾丁寡糖重組枯草芽孢桿菌。

在本發明的一種實施方式中，所述枯草芽孢桿菌為Bacillus subtilis 168；所述重組表達載體為pP43NMK。

本發明的第三個目的是提供一種應用上述重組枯草芽孢桿菌發酵生產幾丁寡糖的方法，是應用所述積累幾丁寡糖的重組枯草芽孢桿菌進行發酵，于35～37℃、200～220rpm下培養10～16h的重組枯草芽孢桿菌以5％的接種量轉入發酵培養基，于35～37℃、180～220rpm條件下發酵36～54h。