[發明專利]基于雞源類泛素蛋白融合表達體系的疫苗制備方法

在審

• 申請號: 201810324885.9
• 申請日: 2018-04-12
• 公開（公告）號: CN108524928A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 辛波;李守軍;黃燦平;付旭彬;劉海霞;陳文娟;李蓬飛;范鐘允
• 申請（專利權）人: 天津瑞普生物技術股份有限公司;天津市濱海新區瑞普生物研究院
• 主分類號: A61K39/17
• 分類號: A61K39/17;A61K39/12;A61P31/14;C12N15/62;C12N15/70
• 代理公司: 天津合正知識產權代理有限公司 12229
• 代理人: 陳松

本發明提供了一種基于雞源類泛素蛋白融合表達體系的疫苗制備方法，該方法首先對SUMO?1、SUMO?2及SUMO?3核苷酸序列按照大腸桿菌密碼子的偏好性進行了優化。在此基礎上，將SUMO蛋白編碼序列連接至抗原蛋白編碼基因N端，并連接到pET28a質粒，轉化E.coli DH5α感受態細胞，得到重組質粒。測序確認無核苷酸突變后，轉化E.coli BL21(DE3)感受態細胞。本發明構建的融合表達體系，具有制備基因工程亞單位疫苗的明顯優勢，新城疫HI效價幾何平均值達1:67?1:80，雞傳染性法氏囊病瓊擴效價為1:32?1:64，均明顯高于未使用雞源SUMO蛋白融合表達效價。該方法還適用于蛋雞減蛋綜合癥等雞傳染性疾病的亞單位疫苗制備。

技術領域

本發明涉及獸用生物制品技術領域，進一步涉及基因工程亞單位疫苗技術，具體涉及基于雞源類泛素蛋白融合表達體系的疫苗制備方法。

背景技術

新城疫、雞傳染性法氏囊病、蛋雞減蛋綜合癥等是嚴重危害養雞業發展的重要疫病。目前，我國對這幾種疾病的防控主要依賴于疫苗免疫。

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一種禽類急性、高度接觸性傳染病。新城疫病毒的感染能力主要是由兩個外膜蛋白決定的:一個是血凝素神經氨酸酶(HN)，另一個是融合蛋白(F)。HN蛋白參與病毒粒子與宿主細胞表面受體吸附過程，F蛋白是NDV感染細胞所必需的，它不僅能促進病毒囊膜與宿主細胞膜融合，而且能促進相鄰宿主細胞之間發生融合，是構成NDV致病力的重要成分，也是誘導機體產生中和抗體的主要抗原。

傳染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，該病僅使雞感染致病死亡，生產性能下降，。IBDV主要侵害雛雞的中樞免疫器官法氏囊，引起嚴重免疫抑制，從而導致免疫抑制和免疫缺陷，同時造成其他疫苗的免疫失敗，是目前危害世界養禽業的主要傳染病之一。VP2作為病毒主要結構蛋白，含有血清型特異性、能誘導中和抗體的構象依賴性抗原表位，其誘導的中和抗體能被動地保護宿主不受IBDV的感染，是IBD的保護性抗原。

在雞傳染性疾病的亞單位疫苗研發中，通過大腸桿菌表達體系表達關鍵抗原蛋白是一種常見方法。但常見問題表現為重組蛋白表達量低、修飾不完全造成的蛋白表達形式多為沉淀，蛋白結構錯誤折疊而導致免疫效力不夠高，從而導致疫苗生產成本偏高。

類泛素蛋白SUMO是一種小分子泛素相關修飾蛋白，是存在于真核生物中參與蛋白質小泛素化修飾的一類高度保守的小分子蛋白。SUMO可作為重組蛋白表達的融合標簽，具備分子伴侶的功能，能促進蛋白的正確折疊，對熱和蛋白酶具有耐受性，有助于保持目的蛋白的穩定性。釀酒酵母中有一個SUMO基因(SMT3)，脊椎動物有三個SUMO基因，分別為SUMO-1、SUMO-2和SUMO-3。

目前，商業化載體中SUMO來源于釀酒酵母中，但根據目前報道，后續蛋白表達后需將該標簽蛋白切除，工藝繁瑣。通常，在體外環境中，SUMO蛋白酶還存在剪切效率問題，未經完全切除的釀酒酵母SUMO標簽免疫動物后，還會存在針對標簽的抗體產生免疫反應，或者遮蔽抗原蛋白免疫反應的現象。而自體來源的SUMO蛋白可避免類似問題的出現。目前尚未有關于利用雞源類泛素蛋白融合表達體系，進行雞傳染性疾病關鍵抗原蛋白表達，從而制備重組亞單位疫苗的相關報道。

發明內容

本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種基于雞源類泛素蛋白融合表達體系的疫苗制備方法，以解決現有技術中常規方法中抗原、可溶性蛋白的表達量及免疫效力較低的技術問題。

本發明要解決的另一技術問題是現有技術中常規方法多制備的產品其排異反應發生率較高。

為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：