[發明專利]基于雞源類泛素蛋白融合表達體系的疫苗制備方法

在審

• 申請號: 201810324885.9
• 申請日: 2018-04-12
• 公開（公告）號: CN108524928A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 辛波;李守軍;黃燦平;付旭彬;劉海霞;陳文娟;李蓬飛;范鐘允
• 申請（專利權）人: 天津瑞普生物技術股份有限公司;天津市濱海新區瑞普生物研究院
• 主分類號: A61K39/17
• 分類號: A61K39/17;A61K39/12;A61P31/14;C12N15/62;C12N15/70
• 代理公司: 天津合正知識產權代理有限公司 12229
• 代理人: 陳松

1.基于雞源類泛素蛋白融合表達體系的疫苗制備方法，其特征在于該方法中的抗原是將雞自體類泛素蛋白SUMO-1、SUMO-2或SUMO-3基因，與雞新城疫病毒或雞傳染性法氏囊病病毒的結構蛋白編碼基因融合，再在大腸桿菌中進行表達從而獲得的。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述SUMO-1基因的序列如SEQ ID No:1所示。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述SUMO-2基因的序列如SEQ ID No:2所示。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述SUMO-3基因的序列如SEQ ID No:3所示。

5.根據權利要求1所述的基于雞源類泛素蛋白融合表達體系的疫苗制備方法，其特征在于該方法是將新城疫病毒截短F蛋白與SUMO-1基因融合；該方法包括以下步驟：

1)利用序列為TACACCTCATCCCAGACAGGATC和ACCAGTCATGCTAGCGCTGAGTTGATTGTTCCCTATACC的引物擴增新城疫病毒毒株B1的F蛋白表達基因；

2)利用序列為TGCCGCGCGGCAGCCATATGAGCGATCAGGAAGC和CTGGGATGAGGTGTAGGATCCACCGGTCTGTTC的引物擴增SUMO-1基因；

3)利用序列為TGCCGCGCGGCAGCCATATGTACACCTCATCCCAGACAGGATC和ACCAGTCATGCTAGCGCTGAGTTGATTGTTCCCTATACC的引物執行PCR擴增使F蛋白基因與pET28a(+)進行連接；

4)提取用于表達蛋白的質粒pET28a(+)，檢測其濃度，并使用限制性內切酶NdeI進行單酶切；

5)將PCR獲得的DNA及單酶切的質粒DNA進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，并切割目的條帶，使用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段；

6)使用MultiS One step Cloing Kit進行片段的連接；其中，酶切后的質粒與SUMO-1、F蛋白基因進行連接；酶切后的質粒與F蛋白基因單獨進行連接；

7)將連接產物轉化后篩選陽性克隆，將獲得的質粒分別轉化至表達宿主E.coli BL21；通過篩選帶有卡納抗性的LB平板，得到正確的克隆；

8)從抗性平板上挑取單菌落接種于含有LB培養基的搖管中，37℃培養過夜；將培養得到的菌液以1％的接種量轉接到含有50ml LB培養基的500ml三角瓶中，于37℃振蕩培養至OD_620nm為0.6；向上述培養液中加入終濃度為1mM的IPTG，16℃搖床誘導表達8h；收集菌體，并用PBS洗滌兩遍，然后PBS重懸菌體沉淀，同時調整OD_620nm至30；超聲波破碎菌體細胞，12,000rpm低溫離心10min，收集上清液；

9)將收集的上清液按比例加入10％甲醛溶液，甲醛溶液最終濃度為0.2％，37℃下進行滅活12h，以除去大腸桿菌；

10)將無菌的蛋白上清液進行配苗。

6.根據權利要求1所述的基于雞源類泛素蛋白融合表達體系的疫苗制備方法，其特征在于該方法是將雞傳染性法氏囊病VP2蛋白與SUMO-1基因融合；該方法包括以下步驟：

1)利用序列為ATGACAAACCTGCAAGATCAAACC和TGTCCACCAGTCATGCTAGCTTACCTTATGGCCCGGATTATGT的引物擴增VP2蛋白表達基因；

2)利用序列為TGCCGCGCGGCAGCCATATGAGCGATCAGGAAGC和TGATCTTGCAGGTTTGTCATGGATCCACCGGTCTGTTC的引物擴增SUMO-1基因；

3)利用序列為TGCCGCGCGGCAGCCATATGATGACAAACCTGCAAGATCAAACC和TGATCTTGCAGGTTTGTCATTTACCTTATGGCCCGGATTATGT的引物執行PCR擴增使VP2蛋白基因與pET28a(+)進行連接；

4)提取用于表達蛋白的質粒pET28a(+)，檢測其濃度，并使用限制性內切酶NdeI進行單酶切；

5)將PCR獲得的DNA及單酶切的質粒DNA進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，并切割目的條帶，使用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段；

6)使用MultiS One step Cloing Kit進行片段的連接；其中，酶切后的質粒與SUMO-1、VP2蛋白基因進行連接；酶切后的質粒與VP2蛋白基因單獨進行連接；

7)將連接產物轉化后篩選陽性克隆，將獲得的質粒分別轉化至表達宿主E.coli BL21；通過篩選帶有卡納抗性的LB平板，得到正確的克隆；

8)從抗性平板上挑取單菌落接種于含有LB培養基的搖管中，37℃培養過夜；將培養得到的菌液以1％的接種量轉接到含有50ml LB培養基的500ml三角瓶中，于37℃振蕩培養至OD_620nm為0.6；向上述培養液中加入終濃度為1mM的IPTG，16℃搖床誘導表達8h；收集菌體，并用PBS洗滌兩遍，然后PBS重懸菌體沉淀，同時調整OD_620nm至30；超聲波破碎菌體細胞，12,000rpm低溫離心10min，收集上清液；

9)將收集的上清液按比例加入10％甲醛溶液，甲醛溶液最終濃度為0.2％，37℃下進行滅活12h，以除去大腸桿菌；

10)將無菌的蛋白上清液進行配苗。