[發(fā)明專利]一種蛋鴨小卵泡膜細(xì)胞的分離提取方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810324356.9
• 申請日: 2018-04-11
• 公開（公告）號: CN108277200B
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 羅茜;陳偉
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

本發(fā)明公開了一種蛋鴨小卵泡膜細(xì)胞的分離提取方法，包括以下步驟：選取一只產(chǎn)蛋期蛋鴨，解剖剪取卵巢組織，分離出卵泡；剝離小卵泡外的結(jié)締組織層，固定住卵泡后將小卵泡剪破，將卵泡膜翻轉(zhuǎn)，卵泡膜內(nèi)層朝上，刮除卵黃和顆粒細(xì)胞層；在卵泡膜層中加入Ⅱ型膠原蛋白酶消化液，進(jìn)行消化處理；再次刮除上述的組織內(nèi)外兩面細(xì)胞，吹打、沖洗組織層；將沖洗干凈的組織層置于新配置的Ⅱ型膠原蛋白酶消化液中，進(jìn)行消化處理；將組織剪成碎片，進(jìn)行消化處理；將混懸液用細(xì)胞網(wǎng)篩過濾，收集濾液，加入胎牛血清終止消化，離心收集細(xì)胞沉淀，制備得到蛋鴨小卵泡膜細(xì)胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于家禽育種技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種蛋鴨小卵泡膜細(xì)胞的分離提取方法。

背景技術(shù)

家禽卵泡膜細(xì)胞是卵泡的重要組成部分，圍繞在顆粒層外周的一層扁平細(xì)胞，其在卵泡發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。目前卵泡相關(guān)研究中，人們更多的關(guān)注是顆粒細(xì)胞而忽略了卵泡膜細(xì)胞。卵泡膜細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)是研究卵泡膜在卵泡發(fā)育中作用機(jī)制的關(guān)鍵。

現(xiàn)研究報道中，鮮有關(guān)于水禽小卵泡的卵泡膜細(xì)胞體外培養(yǎng)報道，這樣，無法全面了解蛋鴨小卵泡卵泡膜細(xì)胞在卵泡發(fā)育中的生理過程。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種蛋鴨小卵泡膜細(xì)胞的分離提取方法，該方法細(xì)胞純度高，活力好，分離密度高。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種蛋鴨小卵泡膜細(xì)胞的分離提取方法，包括以下步驟：

步驟1、選取一只產(chǎn)蛋期蛋鴨，解剖剪取卵巢組織，分離出3-6mm小卵泡，將小卵泡置于盛有滅菌PBS的培養(yǎng)皿中；

步驟2、用眼科鑷剝離小卵泡外的結(jié)締組織層，固定住卵泡后用眼科剪將小卵泡剪破，將卵泡膜翻轉(zhuǎn)，卵泡膜內(nèi)層朝上，用眼科鑷刮除卵黃和顆粒細(xì)胞層；

步驟3、在卵泡膜層中加入Ⅱ型膠原蛋白酶消化液，置于干凈的培養(yǎng)皿中，并放置在培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化處理；

步驟4、用鑷子再次刮除步驟3中的組織內(nèi)外兩面細(xì)胞，吹打、沖洗組織層；

步驟5、將步驟4中沖洗干凈的組織層置于新配置的Ⅱ型膠原蛋白酶消化液中，進(jìn)行消化處理；

步驟6、將步驟5制備得到的組織剪成碎片，加入新配置的Ⅱ型膠原蛋白酶消化液進(jìn)行消化處理；

步驟7、將混懸液用細(xì)胞網(wǎng)篩過濾，收集濾液，加入胎牛血清終止消化，離心收集細(xì)胞沉淀，制備得到蛋鴨小卵泡膜細(xì)胞。

可選地，所述步驟3中Ⅱ型膠原蛋白酶消化液與卵泡膜層的體積質(zhì)量比(ml/g)為0.2％；消化時間為25-35min，消化溫度為37℃。

可選地，所述步驟5中新配置的Ⅱ型膠原蛋白酶消化液與步驟4中沖洗干凈的組織層的體積質(zhì)量比(ml/g)為0.2％；消化時間為15-25min，消化溫度為37℃，每隔5min吹打組織。

可選地，所述步驟6中新配置的Ⅱ型膠原蛋白酶消化液與步驟5制備得到的組織的體積質(zhì)量比(ml/g)為0.2％；消化時間為35-45min，消化溫度為37℃，每隔15min吹打組織。

可選地，所述步驟7中胎牛血清的體積濃度為10％，細(xì)胞篩網(wǎng)的目數(shù)為250目，離心轉(zhuǎn)速為400g，離心時間10min。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)本發(fā)明首次分離提取蛋鴨小卵泡膜細(xì)胞。

2)本發(fā)明通過多次消化、吹洗步驟減少了卵黃和顆粒細(xì)胞的污染，得到純度高的膜細(xì)胞。

當(dāng)然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說明