[發明專利]一種蛋鴨小卵泡膜細胞的分離提取方法有效
| 申請號： | 201810324356.9 | 申請日： | 2018-04-11 |
| 公開（公告）號： | CN108277200B | 公開（公告）日： | 2021-07-16 |
| 發明（設計）人： | 羅茜;陳偉 | 申請（專利權）人： | 廣東省農業科學院動物科學研究所 |
| 主分類號： | C12N5/071 | 分類號： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465 | 代理人： | 李冉 |
| 地址： | 510640 廣東*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 蛋鴨 卵泡 細胞 分離 提取 方法 | ||
1.一種蛋鴨小卵泡膜細胞的分離提取方法，其特征在于，包括以下步驟：
步驟1、選取一只產蛋期蛋鴨，解剖剪取卵巢組織，分離出3-6mm小卵泡，將小卵泡置于盛有滅菌PBS的培養皿中；
步驟2、用眼科鑷剝離小卵泡外的結締組織層，固定住卵泡后用眼科剪將小卵泡剪破，將卵泡膜翻轉，卵泡膜內層朝上，用眼科鑷刮除卵黃和顆粒細胞層；
步驟3、在卵泡膜層中加入Ⅱ型膠原蛋白酶消化液，置于干凈的培養皿中，并放置在培養箱中進行消化處理；其中Ⅱ型膠原蛋白酶消化液與卵泡膜層的體積質量比(ml/g)為0.2％；消化時間為25-35min，消化溫度為37℃；
步驟4、用鑷子再次刮除步驟3中的組織內外兩面細胞，吹打、沖洗組織層；
步驟5、將步驟4中沖洗干凈的組織層置于新配置的Ⅱ型膠原蛋白酶消化液中，進行消化處理；其中新配置的Ⅱ型膠原蛋白酶消化液與沖洗干凈的組織層的體積質量比(ml/g)為0.2％；消化時間為15-25min，消化溫度為37℃，每隔5min吹打組織；
步驟6、將步驟5制備得到的組織剪成碎片，加入新配置的Ⅱ型膠原蛋白酶消化液進行消化處理；其中新配置的Ⅱ型膠原蛋白酶消化液與步驟5制備得到的組織的體積質量比(ml/g)為0.2％；消化時間為35-45min，消化溫度為37℃，每隔15min吹打組織；
步驟7、將混懸液用細胞網篩過濾，收集濾液，加入胎牛血清終止消化，離心收集細胞沉淀，制備得到蛋鴨小卵泡膜細胞。
2.根據權利要求1所述的分離提取方法，其特征在于，所述步驟7中胎牛血清的體積濃度為10％，細胞篩網的目數為250目，離心轉速為400g，離心時間10min。
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