[發明專利]一株減毒銅綠假單胞菌的構建方法及其在蛋白質轉染中的應用

有效

• 申請號: 201810324073.4
• 申請日: 2018-04-12
• 公開（公告）號: CN108359630B
• 公開（公告）日: 2021-07-02
• 發明（設計）人: 白芳;劉穎;吳衛輝;靳永新;程志暉;劉暢;許譯天;鄭瑞萍
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/85;C12R1/385
• 代理公司: 天津耀達律師事務所 12223
• 代理人: 侯力

一株減毒銅綠假單胞菌的構建方法及其在蛋白質轉染中的應用。構建方法是，將銅綠假單胞菌Δ8菌株中參與細胞壁肽聚糖合成的谷氨酸消旋酶基因murI刪除，從而獲得D?谷氨酸營養缺陷型菌株Δ9。其應用是，Δ9菌株無細胞毒性并保留有完好的III型分泌系統(T3SS)，可將外源蛋白質通過其T3SS高效地注入到哺乳動物細胞中，能夠應用于哺乳動物細胞蛋白質轉染。Δ9在缺少D?谷氨酸的培養環境中無法生長，因此，轉染后該菌可通過D?谷氨酸營養限制自行清除。我們分別利用HeLa細胞和小鼠感染模型闡釋了該菌體外和體內應用的安全性。本發明對于開發安全、高效的哺乳動物細胞蛋白質轉染技術有著積極的意義。

【技術領域】

本發明屬于生物技術領域，涉及一株減毒銅綠假單胞菌的構建方法及其在哺乳細胞蛋白質轉染方面的應用。

【背景技術】

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)為革蘭氏陰性菌，這類細菌細胞壁的主要成分是肽聚糖，是原核生物細胞所特有的物質。肽聚糖由聚糖骨架、四肽側鏈和五肽交聯橋三部分組成。聚糖骨架由N-乙酰葡糖胺(N-acetyl glucosamine，GlcNAc)和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid，MurNAc)交替間隔排列，經β-1,4糖苷鍵聯結而成。四肽側鏈由L-丙氨酸、D-谷氨酸、L-賴氨酸和D-丙氨酸依次排列組成；第三位的L-賴氨酸由5個甘氨酸組成的五肽交聯橋連接到相鄰聚糖骨架四肽側鏈末端的D-丙氨酸，從而構成機械強度十分堅韌的三維立體結構。D-谷氨酸摻入到四肽側鏈的第二個殘基上在原核生物中是高度保守的。

功能性D-谷氨酸(D-Glu)是由MurI通過改變同名L-谷氨酸立體化學式結構生成的。MurI是一類不需輔助因子，專一催化L型和D型谷氨酸之間相互轉化的酶，為細胞壁合成提供D-谷氨酸，是細菌生長的關鍵酶。通過對銅綠假單胞菌的基因組分析可知，MurI由單一的murI基因編碼。對細菌細胞壁合成所需的酶的編碼基因murI進行突變，從而使細菌不能形成完整的細胞壁，逐漸導致細菌消亡。

銅綠假單胞菌PAK具有III型分泌系統(T3SS)，它是一種錨定在細菌表面的針狀復合結構，細菌利用該系統能夠將自身的毒力蛋白ExoS、ExoT和ExoY高效地注入到宿主細胞體內，是自然界存在的一種高效的蛋白質注入機制。銅綠假單胞菌之所以具有較強的感染能力和致病能力，也與這些毒素蛋白注入靶細胞息息相關。由于細菌的T3SS是一種高效、快速的蛋白質分泌系統，已被廣泛應用于哺乳動物細胞的蛋白質轉染。然而，通過細菌T3SS對哺乳動物細胞進行蛋白質轉染后，如何將細菌徹底清除就成為重要的課題。

在細菌感染細胞的模型中，細菌與細胞長時間的接觸，仍然會產生較大的細胞毒性，因此必須將細胞中的細菌除去。目前，通過細菌T3SS對哺乳動物細胞進行蛋白質轉染后，大多數采用抗生素對細菌進行清除。前期研究表明，高濃度抗生素(如環丙沙星)的使用對多能干細胞(如人胚胎干細胞)的轉錄組有顯著性影響，雖然尚未有證據表明這種影響會導致其細胞干性的喪失，但抗生素殺菌所產生的副作用不容忽視。因此我們將進一步優化這種蛋白質轉染系統，構建低濃度抗生素或者無抗生素處理即可自行清除的蛋白質轉染菌株。

【發明內容】

本發明的目的是解決細菌利用其T3SS對哺乳動物細胞進行蛋白質轉染后，如何將細菌徹底清除的問題，進而構建一種D-谷氨酸營養缺陷的減毒銅綠假單胞菌基因工程菌株，該菌在缺失D-谷氨酸的環境中生長受到限制，但仍具備正常的生理功能，這些細菌可以通過其T3SS對靶細胞進行蛋白質轉染，而后由于無法合成新的細胞壁而最終死亡。該發明通過營養限制策略解決了蛋白質轉染菌株的清除問題，降低了細菌毒力的同時提升了蛋白質轉染量，使細菌T3SS介導的蛋白質轉染技術更為安全、高效。

本發明的技術方案

一株減毒銅綠假單胞菌的構建方法，該方法包括：