[發明專利]一株減毒銅綠假單胞菌的構建方法及其在蛋白質轉染中的應用

有效

• 申請號: 201810324073.4
• 申請日: 2018-04-12
• 公開（公告）號: CN108359630B
• 公開（公告）日: 2021-07-02
• 發明（設計）人: 白芳;劉穎;吳衛輝;靳永新;程志暉;劉暢;許譯天;鄭瑞萍
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/85;C12R1/385
• 代理公司: 天津耀達律師事務所 12223
• 代理人: 侯力

1.一株減毒銅綠假單胞菌的構建方法，其特征在于：具體步驟包括：

以Δ8菌株基因組DNA為模板，PCR擴增得到murI的上下游1-kb的同源臂片段；上述PCR產物經酶切后克隆到質粒pEX18Tc上，構建基因敲除質粒pEX18Tc-murI；提取保存在DH5a中的基因敲除質粒，使用化學轉化的方法將質粒分別轉化到大腸桿菌S17感受態細胞中；采用接合轉移的方法將S17中的基因敲除質粒轉入到Δ8菌株中，對Δ8基因組中的murI基因進行敲除；在含有50μg/mL四環素的瓊脂糖平板上篩選單側同源臂發生同源重組的單交換菌株，然后在含有7.5％蔗糖的瓊脂糖和10mM D-Glu的平板上篩選雙側同源臂均 發生同源重組的菌株，最終獲得突變株Δ9；

該菌對哺乳動物細胞無細胞毒性，在不添加外源的D-谷氨酸時無繁殖能力，能夠通過D-谷氨酸營養缺陷限制抑制細菌的增殖；Δ9菌株的III型分泌系統具有完整功能，能夠在短時間內實施對哺乳動物細胞的蛋白質轉染；

所述銅綠假單胞菌Δ8菌株為敲除PAK-J菌株染色體上的exoS、exoT、exoY、ndk、popN、rhlR-I、lasR-I和xcpQ基因所得。

2.根據權利要求1所述的減毒銅綠假單胞菌的構建方法，其特征在于：以10⁸CFU的Δ9菌株感染哺乳動物細胞4小時無顯著的細胞毒性產生。

3.根據權利要求1所述的減毒銅綠假單胞菌的構建方法，其特征在于：菌株Δ9在補充10mM D-谷氨酸的培養基中可正常生長；而不添加外源的D-谷氨酸時，細菌無法繁殖；在D-谷氨酸營養限制條件下，以10⁸CFU的Δ9菌株感染HeLa細胞4小時后，用PBS洗去浮游細菌，殘留細菌經抗生素處理15小時可徹底清除。

4.根據權利要求1所述的減毒銅綠假單胞菌的構建方法，其特征在于：由于哺乳動物體內環境無D-谷氨酸，以10⁸CFU的Δ9菌株感染小鼠，12小時后，小鼠各器官內細菌的存活率幾乎為零，且在小鼠體內引起的炎癥反應較弱。

5.根據權利要求1所述的減毒銅綠假單胞菌的構建方法，其特征在于：菌株Δ9具有完整的III型分泌系統，Δ9菌株在無D-谷氨酸培養基中仍保留完好的III型蛋白質分泌功能，在接觸到哺乳動物細胞的時候細菌的III型分泌被激活，能夠高效地向哺乳動物細胞內注入效應蛋白。

6.權利要求1所述方法構建的菌株Δ9的應用，其特征在于：所述的減毒菌株Δ9應用于體外哺乳動物細胞的蛋白質轉染，即通過將目標蛋白與III型分泌系統信號肽ExoS54融合表達于表達載體pExoS54F中，當攜帶有該表達載體的Δ9菌株與哺乳動物細胞共同培養的時候，Δ9的III型分泌系統被激活，目標蛋白與ExoS54融合表達，從而通過III型分泌系統的針狀復合物被注入到哺乳動物細胞當中。

7.根據權利要求6所述的菌株Δ9的應用，其特征在于：所注入的目標蛋白為轉錄因子，酶，疫苗，結構蛋白或效應因子。

8.根據權利要求6所述的菌株Δ9的應用，其特征在于：所述的工程菌株Δ9應用于各種哺乳動物細胞系的蛋白質轉染，所述的細胞系包括人和鼠的皮膚細胞、肌細胞、腸道細胞、肝細胞、免疫細胞和誘導性多能干細胞。