[發明專利]一種利用植物激素GA及小分子物質PAC調節細胞通路的方法

有效

• 申請號: 201810323796.2
• 申請日: 2018-04-12
• 公開（公告）號: CN108410908B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 左澤乘;張峻川;莫偉亮;張力;肖勇;石翔;張寶昌;張文禮;李蘇迪
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊;饒文君

本發明提供了一種利用植物激素GA及小分子物質PAC調節細胞通路的方法，實現了人細胞內信號通路的調控開關。將擬南芥內GA受體蛋白GID1及GAI構建在人細胞表達載體上，然后一起轉入HEK293T細胞，加入GA，誘導兩個蛋白相互作用，加入抑制劑PAC后，互作程度會減弱。利用這種方式，將人細胞信號通路中的關鍵蛋白與這兩個受體蛋白融合表達，兩個受體蛋白在GA誘導下互作，導致融合的信號通路也受GA的誘導。本發明選擇了人Wnt通路上的關鍵蛋白LRP6。融合表達GA受體以及LRP6以后，LRP6會在GA誘導下聚集，進而促進β?連環蛋白的產生，打開細胞內的信號通路，加入PAC抑制后，β?連環蛋白產生量減少，細胞通路關閉。

技術領域

本發明涉及生物方法發明領域，具體的說，是一種利用植物激素GA以及小分子物質PAC調節細胞通路的方法。

背景技術

光遺傳學是一種將光控技術與遺傳學相結合以進行細胞生物學研究的新技術，即將光敏感的離子通道蛋白表達于可興奮的靶細胞或靶器官上，利用相應波長的光照激活光敏感通道以實現對細胞、組織、器官及動物生理功能的精細調控，到目前為止，許多光受體被改良，用于融合信號通路上的關鍵蛋白，來調控和控制生物體內的眾多通路，如受體酪氨酸激酶Ras-MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路和Wnt信號通路。在基因水平上, 研究者利用CRY2-CIB1、FKF1-GI、UVR8-COP1和LOV蛋白等元件來調控哺乳動物細胞中特定基因的轉錄表達。有研究將擬南芥藍光受體CRY2與Wnt信號通路內的LRP6蛋白融合表達，實驗證明，藍光誘導下CRY2的聚集同樣使融合表達的LRP6發生聚集作用。從而調控了下游β-catenin信號通路。

麻省理工大學的張峰實驗室利用免疫抑制因子雷帕霉素（Rapamycin）控制其受體蛋白并與dCas9構成了一個轉錄激活系統。張峰將受體蛋白FKBP與dCas9的C端以及轉錄激活子VP64融合表達；FRB與dCas9的N端融合表達。將這兩個載體以及sgRNA共同轉入細胞內，雷帕霉素處理后，靶基因的轉錄被激活。然而，此方法和光遺傳學都有一定限制。雷帕霉素是免疫抑制子，對免疫系統有一定傷害；光遺傳學的系統不適合于細胞內的光信號通路的調控。

受到光遺傳學（optogenetics）中利用光受體進而調控相關細胞信號通路的啟發，我們設想利用化學小分子物質植物激素GA來誘導受體蛋白的互作，從而來調控細胞信號轉導。

赤霉素（Gibberellic Acid，GA）作為植物激素的地位是在20世紀50年代確立的。GA的典型生理作用就是顯著地促進植物莖節的伸長生長，并在從種子萌發到開花結果等植物的各種生理活動中扮演重要的角色。GA是一種雙萜酸化合物，無毒性，對人的健康不會造成任何危害。相反曾有報道說服用適量的赤霉素可以治療胃潰瘍，胃粘膜受損等疾病。GA信號通路依賴傳導需要受體蛋白GID1（GA INSENSITIVE DWARF1），GA結合GID1促進GID1N端構像的變化，GA-GID1復合物可以結合GA信號抑制子DELLA蛋白家族。促進DELLA蛋白被26s蛋白酶體降解從而激活GA的信號通路。GAI就是DELLA蛋白的其中一員。多效唑(Paclobutrazol)PAC是一種植物生長的抑制劑，PAC可以通過抑制GA的生物活性對GA產生拮抗作用。

利用GA誘導GID1與GAI蛋白互作，PAC抑制這個過程的特性，以及光遺傳學的原理，我們試著研發一種以無毒害的天然植物激素為誘導劑，調控細胞內信號通路的系統。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用植物激素GA以及小分子物質PAC調節細胞通路的方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種利用植物激素GA以及小分子物質PAC調節細胞通路的方法，包括以下方法：

（1）載體設計以及構建：