[發(fā)明專利]一種利用植物激素GA及小分子物質(zhì)PAC調(diào)節(jié)細胞通路的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810323796.2
• 申請日: 2018-04-12
• 公開（公告）號: CN108410908B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 左澤乘;張峻川;莫偉亮;張力;肖勇;石翔;張寶昌;張文禮;李蘇迪
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊;饒文君

1.一種利用植物激素GA及小分子物質(zhì)PAC調(diào)節(jié)細胞通路的方法，其特征在于：采用以下引物：

GID1-F：GCGTGGTACCTCTAGAATGGCTGCGAGCGATGAAGT，

GID1-R：GAAGCGGCCGCCCGGGTTAACATTCCGCGTTTACAA；

GID1-F：GCGTGGTACCTCTAGAATGGCTGCGAGCGATGAAGT，

GID1-LRP6C-R：CCCGAGCCACCGCCGGAACCGCCACCTTAACATTCCGCGTTTACAA；

LRP6C-F：GGCGGTGGCTCGGGAGGTGGCTCAAGGATGTTGTGTCCACGTAT，

LRP6C-R：GAAGCGGCCGCCCGGGTCAGGAGGAGTCTGTACAGG；

GAI-F：GCGTGGTACCTCTAGAATGAAGAGAGATCATCATCA，

GAI-R：GAAGCGGCCGCCCGGGATTGGTGGAGAGTTTCCAAG；

GAI-F：GCGTGGTACCTCTAGAATGAAGAGAGATCATCATCA，

GAI-LRP6C-R：CCCGAGCCACCGCCGGAACCGCCACCATTGGTGGAGAGTTTCCAAG；

LRP6C-F：GGCGGTGGCTCGGGAGGTGGCTCAAGGATGTTGTGTCCACGTAT，

LRP6C-R：GAAGCGGCCGCCCGGGTCAGGAGGAGTCTGTACAGG；

包括以下步驟：

（1）載體設(shè)計以及構(gòu)建：

首先利用所述的引物，以擬南芥和HEK293T細胞反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用pcr技術(shù)將各基因片段擴增出來，然后利用對應(yīng)引物，用兩段片段為模板，進行overlap PCR，將擬南芥DELLA蛋白GAI及GA受體GID1與Wnt信號通路內(nèi)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)LRP6的C端，融合到一起，利用瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物GAI、GID1、GAI-LRP6C、GID1-LRP6C，用內(nèi)切酶XbaI XmaI雙酶切線性化的pCI 4xmyc、pCI egfp以及pCI mcherry載體，利用Infusion的方法連接，轉(zhuǎn)化DH5a，菌落pcr驗證，挑取克隆送測序，測序正確的保菌；利用以上操作，構(gòu)建獲得動物表達載體pCI-neo egfp GAI、 pCI-neo 4xMYC GID，pCI-neo mcherry GID-LRP6C，pCI-neo 4xMYCGID-LRP6C，pCI-neo egfp GAI-LRP6C；

（2）動物細胞的培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)染：

將凍存的HEK293T細胞從液氮中取出，37℃水浴迅速復(fù)蘇細胞，接著放入離心機，800g離心5min，棄上清，加入1ml DMEM高糖細胞培養(yǎng)液重懸細胞，將細胞懸液加入含有預(yù)熱過的10mlDMEM培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)瓶中，24h后更換培養(yǎng)基，待細胞的生長率到90%，將細胞重懸并且轉(zhuǎn)移至6孔板內(nèi)，轉(zhuǎn)移24h后，進行磷酸鈣法細胞轉(zhuǎn)染，在六孔板每孔轉(zhuǎn)染pCI-neo egfpGAI、 pCI-neo 4xMYC GID兩種質(zhì)粒或者pCI-neo 4xMYC GID-LRP6C、pCI-neo egfp GAI-LRP6C兩種質(zhì)粒各2微克；

（3）GA以及PAC的給藥

轉(zhuǎn)染24h后，加入終濃度為10μM的GA，和細胞在37℃，5%CO₂中共同孵育12h，再加入終濃度為100nM的抑制劑PAC，孵育3h；孵育完成后，重懸細胞，利用細胞裂解液裂解，利用Western進行檢測。