[發明專利]甲魚系統性敗血癥球狀病毒RT-PCR檢測引物及其檢測方法

在審

• 申請號: 201810323694.0
• 申請日: 2018-04-03
• 公開（公告）號: CN110343782A
• 公開（公告）日: 2019-10-18
• 發明（設計）人: 李登峰;林威;彭嬌
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種甲魚系統性敗血癥球狀病毒的RT?PCR檢測引物及其檢測方法，其引物由正向和反向引物組成，正向引物及其寡核苷酸序列為：STSSSV?F：5’?GGGACCTTACGTTGGTTTCTACAC?3’、反向引物及其寡核苷酸序列為STSSSV?R：5’?GCCCTCCACCAATATACATTTCTC?3’。以該甲魚系統性敗血癥球狀病毒特異性引物組成的檢測方法，是以待測樣品的總RNA為模板進行RT?PCR，對產物進行電泳判定結果。該方法快速、準確、靈敏、特異，適合甲魚系統性敗血癥球狀病毒的快速、準確檢測。

技術領域

本發明涉及一種甲魚系統性敗血癥球狀病毒的引物及其檢測方法，具體涉及甲魚系統性 敗血癥球狀病毒的RT-PCR檢測引物及其檢測方法，屬分子生物學領域。

背景技術

甲魚系統性敗血癥是近年來在浙江寧波、杭州等地乃至全國甲魚生態養殖場發生的嚴重 的爆發性傳染病，該病不斷地在眾多養殖場頻繁爆發，造成嚴重損失。癥狀主要表現為系統 性出血性敗血，死亡嚴重，發病時7-10天內累積死亡率可達90-100％。病鱉主要為體重 150-200g的幼鱉，成鱉也有患病感染。該病的原發性病原為甲魚系統性敗血癥球狀病毒 (Soft-shelled turtle systemic septicemia spherical virus，STSSSV)(保藏于中國微生物保藏 管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.5378，保藏機構地址為：北京市朝陽 區北辰西路1號院3號，郵編：100101；保藏日期為：2011年10月21日。)

水產動物病毒是導致水產養殖大面積死亡從而造成巨大經濟損失的最大隱患。如何快速 準確的預報和診斷水產動物疾病就成為了當前診斷技術的一大難點和重點，在現有的針對水 產動物病毒進行檢測的方法中，應用較多的是病毒分離，組織病理及電鏡觀察等較為原始的 方法，這些方法耗費時間長，操作較復雜。且由于一些病毒在不同的組織中形態、大小可能 會出現一定的差異，容易導致錯誤的檢測結果。核酸檢測技術做為分子生物學檢測技術的核 心，在病毒診斷中發揮著巨大的作用。本課題組率先分離、鑒定了STSSSV，測定了STSSSV 部分基因組序列，確定其為小RNA病毒(Picornavirus)，分析了其保守區域。在此基礎上， 本發明設計了一對特異引物，建立了一種檢測STSSSV的新方法，檢測過程快速、準確、靈 敏、特異，這是首次建立一種針對STSSSV的核酸檢測方法。

發明內容

本發明的目的在于針對目前甲魚病毒檢測技術的不足，提供一種檢測甲魚系統性敗血癥 球狀病毒的RT-PCR檢測引物及其檢測方法，所述RT-PCR，是應用反轉錄PCR(Reverse Transcription PCR，RT-PCR)技術檢測甲魚系統性敗血癥球狀病毒方法，對檢測微量的樣 品中的病毒的效果良好，具有快速、靈敏、特異性強的特點，可用于甲魚系統性敗血癥球狀 病毒感染的監測和甲魚系統性敗血癥的分子流行病學調查等。

本發明的技術方案如下：

一種甲魚系統性敗血癥球狀病毒的RT-PCR檢測引物，其特征在于由一對甲魚系統性敗 血癥球狀病毒STSSSV的特異性引物組成，該特異性引物及其序列為：

正向引物STSSSV-F：5’-GGGACCTTACGTTGGTTTCTACAC-3’

反向引物STSSSV-R：5’-GCCCTCCACCAATATACATTTCTC-3’

本發明利用甲魚系統性敗血癥球狀病毒(STSSSV)的RT-PCR檢測引物，檢測STSSSV的RT-PCR(反轉錄PCR)方法，其特征在于包括下列步驟：

1.RT-PCR：

(1)RNA提?。喝〈郎y甲魚血液或組織、糞便，按照Invitrogen Trizol LS說明書提取 總RNA，用NanoDrop進行核酸定量。

(2)1st-cDNA合成(反轉錄)：