[發明專利]甲魚系統性敗血癥球狀病毒RT-PCR檢測引物及其檢測方法在審
| 申請號： | 201810323694.0 | 申請日： | 2018-04-03 |
| 公開（公告）號： | CN110343782A | 公開（公告）日： | 2019-10-18 |
| 發明（設計）人： | 李登峰;林威;彭嬌 | 申請（專利權）人： | 寧波大學 |
| 主分類號： | C12Q1/70 | 分類號： | C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 315211 浙江省寧波市江北*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 球狀病毒 敗血癥 甲魚 反向引物 寡核苷酸 引物 檢測 總RNA為模板 特異性引物 電泳 待測樣品 判定結果 正向引物 準確檢測 正向 靈敏 | ||
1.一種甲魚系統性敗血癥球狀病毒的RT-PCR檢測引物，其特征在于由1對寡核苷酸引物STSSSV-F和STSSSV-R組成，序列如下：
STSSSV-F：5’-GGGACCTTACGTTGGTTTCTACAC-3’
STSSSV-R：5’-GCCCTCCACCAATATACATTTCTC-3’。
2.一種利用權利要求1所述的引物檢測甲魚系統性敗血癥球狀病毒的RT-PCR方法，其特征在于包括以下步驟：
(1)RT-PCR：
①RNA提取：取待測甲魚血液或組織、糞便，按照Invitrogen Trizol LS說明書提取總RNA，用NanoDrop進行核酸定量；
②1st-cDNA合成：
1st-cDNA合成預處理體系包含RNA 1μg；100nM特異引物STSSSV-R 1μL；加RNasefreeH2O至總體積4μL；
另取一PCR管設為陰性對照，其預處理體系中以1μL RNasefree H2O代替RNA；
預處理體系混勻后，經72℃處理2min后冰上急冷2min；然后加入下列成分，混勻后為1st-cDNA合成體系：
取該1st-cDNA合成體系進行反應，反應溫度及時間為：42℃1.5hour；然后75℃10min，即得到cDNA；
③PCR反應：
PCR反應體系如下：
反應溫度及時間為：94℃預變性4min；94℃ 45s，60℃ 40s，72℃1min，34個循環；72℃10min，即獲得PCR擴增產物；
(2)PCR擴增產物的鑒定：
取PCR擴增產物5μL，點樣于1％瓊脂糖凝膠，于0.5×TAE電泳緩沖液中電泳20min，用凝膠成像系統檢查：結果陰性對照和陰性樣品無目的條帶；而出現約950bp目的條帶的樣品，表示該樣品含有STSSSV。
3.一種如權利要求1所述的引物在檢測甲魚系統性敗血癥球狀病毒上的應用。
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