[發明專利]一種仿生礦化固定化酶和輔因子的制備方法及仿生礦化固定化酶和輔因子

在審

• 申請號: 201810321796.9
• 申請日: 2018-04-11
• 公開（公告）號: CN108715844A
• 公開（公告）日: 2018-10-30
• 發明（設計）人: 高靜;姜艷軍;周麗亞;曹廣秀
• 申請（專利權）人: 河北工業大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14
• 代理公司: 石家莊旭昌知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 13126
• 代理人: 雷瑩

本發明提供了一種仿生礦化固定化酶和輔因子的制備方法及仿生礦化固定化酶和輔因子，包括下列步驟：將酶液溶于磷酸鹽緩沖溶液中，所述酶液中的目的酶帶有組氨酸標簽，將金屬鹽和輔因子加入酶液中，得到溶液A，其中所述金屬鹽中的金屬離子可與所述磷酸根離子形成礦物，所述輔因子帶有負電荷；將所述溶液A混合均勻后在室溫下靜置，得到沉淀B；將含有所述沉淀B的溶液A進行離心、洗滌，得到仿生礦化固定化酶及輔因子。本發明采用仿生礦化法同時將酶和輔因子固定在同一載體上，所得固定化酶和輔因子粒子形貌規則，粒徑約為9～50μm且存在介孔結構；固定化酶和輔因子對高溫、pH有很好的耐受性，重復使用和貯藏穩定性高，且該固定化解決了輔因子難以回收再利用的難題。

技術領域

本發明涉及固定化酶領域，特別涉及一種仿生礦化固定化酶和輔因子的制備方法及仿生礦化固定化酶和輔因子。

背景技術

酶作為生物催化劑，具備反應條件溫和、來源廣泛、無污染、催化效率高、催化專一等優點而受到了人們青睞。但是游離酶穩定性差、難回收利用、易失活的缺點，不僅限制了其廣泛應用而且增加了應用成本。為了解決這項難題，克服游離酶難以分離回收等缺點，固定化酶的理念應運而生，酶被固定化后經簡單的離心等操作即可分離出來，可實現多次重復使用；它還可提高酶的pH穩定性和熱穩定性，避免某些操作步驟對酶活造成影響；相對于游離酶來講，固定化酶的儲藏穩定性也大大提高。總之，固定化酶的出現使生物酶在工業上的自動化生產和連續控制成為可能，同時在理論方面也為酶促反應機理及動力學的研究提供了良好的模型。

輔因子在輔因子依賴型酶的生物催化中發揮重要的作用，因此近年來出現了越來越多的關于輔因子方面的研究。但是輔因子價格昂貴，難以擴大應用，輔因子的原位再生及固定化循環使用成為解決此問題的關鍵。其中，酶和輔因子同時固定化在同一個載體上，可以實現固定化輔因子的回收利用和固定化酶的高效催化，從而提高了酶的廣泛工業應用可能性。因此，對酶和輔因子固定化從而達到可回收的目的，值得進一步研究。

在國內外的研究中，將酶和輔因子固定化在同一個載體上是化學領域的難題。SusanaVelasco-Lozano等人將酶和聚醚酰亞胺不可逆地結合到固體表面，隨后輔因子通過離子交換作用可逆地吸附到聚醚酰亞胺上，通過這種技術獲得的固定化酶和輔因子生物催化劑實現了輔因子的回收利用，具備較高的酶反應催化活性。GiuseppeRulli等人將乙醇脫氫酶和輔因子共同固定在超強吸水劑上，所得固定化酶展現了較高的催化性能，且重復使用性好。Leandro H等將含有高表達ω-轉氨酶的大腸桿菌細胞和PLP成功地固定于大孔的甲基丙烯酸酯珠中，使用有機溶劑抑制PLP的泄露，生物催化劑固定化細胞及輔因子應用于填充床反應器中，該系統具備高通量，清潔生產，高穩定性的特點，構建了一種新的固定化方法。Ji等將輔因子和酶封裝在陽離子聚電解質摻雜的中空納米纖維內腔，實現了輔因子的再生，并發現固定化酶系統具有較高的催化活性和重復使用穩定性。

以上固定化酶及輔因子技術，雖然能得到不同類型的生物催化劑，但是固定化酶的酶活性損失較快，且輔因子難以回收再利用。

發明內容

有鑒于此，本發明旨在提出一種仿生礦化固定化酶和輔因子的制備方法，以制得仿生礦化固定化酶及輔因子。

為達到上述目的，本發明的技術方案是這樣實現的：

一種仿生礦化固定化酶和輔因子的制備方法，包括下列步驟：

S1：將酶液溶于磷酸鹽緩沖溶液中，所述酶液中的目的酶帶有組氨酸標簽，將金屬鹽和輔因子加入酶液中，得到溶液A；所述金屬鹽中的金屬離子可與磷酸根離子形成礦物；所述輔因子帶有負電荷；

S2：將所述溶液A混合均勻后在常溫下靜置，生成沉淀B；

S3：將含有所述沉淀B的溶液A進行離心、洗滌，得到仿生礦化固定化酶及輔因子。

進一步的，所述磷酸鹽緩沖溶液為中性或弱堿性。