[發(fā)明專利]特異性誘導腫瘤細胞凋亡的重組人Fc抗體及其制備方法、用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810319683.5
• 申請日: 2018-04-11
• 公開（公告）號: CN108642070B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發(fā)明（設計）人: 趙洪禮
• 申請（專利權）人: 沈陽金石生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/81;C12N15/85;C07K19/00;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18;A61K38/16;A61K47/64;A61P35/00;C12R1/84
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司 21101
• 代理人: 王勇

1.一種特異性誘導腫瘤細胞凋亡的重組人Fc融合蛋白，其特征是：

(1)通過人工合成的方法直接獲得重組人Fc抗體基因片段，其完整核酸序列為SEQ IDNo: 1，SEQ ID No: 1序列由下列三個基因片段構成：人IgG H鏈Fc片段的基因片段、序列為SEQ ID No: 2；鏈接片段基因、序列為SEQ ID No: 3；VP3基因片段、序列為SQE ID No: 4；

(2) 此重組人Fc抗體的完整氨基酸序列為序列SEQ ID No: 5，該序列由下列3個氨基酸片段構成：IgG H鏈Fc片段的氨基酸片段、序列為SEQ ID No: 6；鏈接片段氨基酸、序列為SEQ ID No: 7；VP3氨基酸片段、序列為SQE ID No: 8。

2.按照權利要求1所述的特異性誘導腫瘤細胞凋亡的重組人Fc融合蛋白，其特征是：所述重組人Fc抗體基因片段亞克隆到酵母表達載體及在酵母細胞中表達；或亞克隆到哺乳細胞表達載體及在哺乳細胞中表達。

3.制備權利要求2所述的特異性誘導腫瘤細胞凋亡的重組人Fc融合蛋白的方法，其特征是：

(1) 重組人Fc抗體酵母工程菌的構建、發(fā)酵及回收，將人工合成的基因片段“Fc-linker-VP3”亞克隆到酵母表達載體pPIC9K載體，轉化畢赤酵母系統GS115菌株，篩選高效表達細胞株，表達重組人Fc抗體蛋白；

(2) 重組人Fc抗體蛋白的純化 取發(fā)酵培養(yǎng)上清緩慢加入等體積的飽和硫酸銨，混勻后4℃放置4小時以上，4℃下5000g離心20min 收集沉淀，沉淀用100ml平衡液溶解，并對平衡液2000平衡液透析12小時以上，中間換夜一次；樣品再上用平衡液平衡好的陰離子層析柱或-20℃ 保存?zhèn)溆茫謩e用含0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L和1mol/LNaCl的平衡液洗脫，收集洗脫峰，SDS電泳鑒定，取含分子量39kD蛋白質部分；用平衡液平衡Separose12層析柱；將上述濃縮的39kD蛋白質部分按床體積的3%比例上樣，流速為2ml/min；分步收集；SDS電泳鑒定后，收集分子量為39kD純度高的蛋白質部分即為重組人Fc抗體；

(3) 純化的重組人Fc抗體鑒定 采用SDS電泳法或高效液相法測定蛋白質純度，純度在95%以上,分子量為39kD，采用紫外分光光度計測定蛋白質含量，為0.5mg/ml。

4.制備權利要求2所述的特異性誘導腫瘤細胞凋亡的重組人Fc融合蛋白的方法，其特征是：

（1）重組人Fc抗體哺乳細胞株的構建、發(fā)酵及回收，將人工合成的基因片段“Fc-linker-VP3”亞克隆到哺乳細胞表達載體pATX2載體，脂質體法轉染哺乳細胞CHO細胞株表達，篩選高效表達細胞株，表達重組人Fc抗體蛋白；

（2）重組人Fc抗體蛋白的純化 取CHO細胞培養(yǎng)上清，緩慢加入等體積的飽和硫酸銨，混勻后4℃放置4小時以上，4℃下5000g離心20min 收集沉淀，沉淀用100ml平衡液溶解，并對平衡液2000平衡液透析12小時以上，中間換夜一次；樣品再上用平衡液平衡好的陰離子層析柱或-20℃ 保存?zhèn)溆茫謩e用含0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L和1mol/LNaCl的平衡液洗脫，收集洗脫峰，SDS電泳鑒定，取含分子量39kD蛋白質部分；用平衡液平衡Separose12層析柱；將上述濃縮的39kD蛋白質部分按床體積的3%比例上樣，流速為2ml/min；分步收集；SDS電泳鑒定后，收集分子量為39kD純度高的蛋白質部分即為重組人Fc抗體；

(3) 純化的重組人Fc抗體鑒定 采用SDS電泳法或高效液相法測定蛋白質純度，純度在96%以上,分子量為39kD，采用紫外分光光度計測定蛋白質含量，為0.5mg/ml。

5.權利要求1或2所述的一種特異性誘導腫瘤細胞凋亡的重組人Fc融合蛋白在制備用于抗惡性腫瘤治療的藥物中的用途。