[發明專利]一種使用寡序列檢測林木染色體端部的方法

有效

• 申請號: 201810319640.7
• 申請日: 2018-04-11
• 公開（公告）號: CN108441539B
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發明（設計）人: 羅小梅;陳亮;劉俊成;萬文林;龔偉;王景燕
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841;C12Q1/6895
• 代理公司: 成都天匯致遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51264
• 代理人: 韓曉銀

本發明提供一種使用寡序列檢測林木染色體端部的方法。該方法通過(AGGGTTT)₃寡序列探針及包含該探針的試劑盒實現，所述(AGGGTTT)₃寡序列探針的堿基序列為：5′?AGGGTTTAGGGTTTAGGGTTT?3′，用于識別并標記林木染色體端部；試劑盒包括：探針；酶解液；20×SSC緩沖液；2×SSC緩沖液；70％FA液；50％DS液；鮭魚精DNA；方法包括:獲取林木染色體載玻片標本；變性；熒光原位雜交；信號檢測；回收載玻片。本發明的方法可反復使用制片，并且探針準備容易、快速，靈敏度高，該探針僅針對染色體端部的寡序列，且根尖制片容易，方便獲取中期染色體，整個實驗流程時間短，操作簡便。

技術領域

本發明屬于熒光原位雜交探針的應用領域，具體涉及一種使用寡序列檢測林木染色體端部的方法。

背景技術

目前，檢測林木染色體的方法多是簡單的顯微觀測，進行照片并分析，林木染色體相對草本植物的要小，很多時候對染色體的數目、大小和形態都不能清晰的區分，造成了實驗的巨大誤差。

熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization，FISH)是在放射性原位雜交技術基礎上發展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術，以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法。FISH能夠更加直觀的觀測林木染色體，高效且快捷，但是對染色體進行熒光標記成為其中的難點。除了缺乏對染色體進行熒光標記的簡單快速方法外，還存在標記過程中所需求的目標DNA數量多，且可能會造成標記錯誤，出現重復標記，導致染色體數目不完整、不清晰等問題。

本發明通過設計、合成用于檢測林木染色體端部的寡序列探針，建立穩定便捷的熒光原位雜交反應體系，克服了現有林木染色體檢測的諸多問題，為林木植物染色體的檢測提供新方法。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供一種使用寡序列檢測林木染色體端部的方法。本發明的技術方案為：

一種使用寡序列檢測林木染色體端部的方法，該方法通過(AGGGTTT)₃寡序列探針及包含該探針的試劑盒實現，所述(AGGGTTT)₃寡序列探針的堿基序列為：5′-AGGGTTTAGGGTTTAGGGTTT-3′，用于識別并標記林木染色體端部；所述試劑盒包括：(1)所述探針；(2)酶解液；(3)20×SSC緩沖液；(4)2×SSC緩沖液；(5)70％FA液；(6)50％DS液；(7)鮭魚精DNA；所述方法包括以下步驟：

1)獲取林木染色體載玻片標本：剪取林木種子新生1.0～1.5cm根尖組織，依次用冰水混合物處理18～24h、冰醋酸處理5min，用雙蒸水清洗后，切取根尖分生組織1～2mm，置于酶解液中于37℃酶解45～60min；

去除酶解液，依次用雙蒸水、70％、90％、100％酒精依次清洗根尖分生組織，再加入冰醋酸制成根尖組織懸浮液，滴于載玻片上，晾干，鏡檢，將能清晰觀察到染色體的載玻片進行標記，并置于-20℃保存箱中保存；

2)變性：準備好滅菌的1.5mL離心管，每管加入2μL鮭魚精DNA，0.5μL探針，然后加入10μL100％FA、2μL 20×SSC和4μL50％DS。混勻后瞬時離心，于沸水浴中變性10min，立即置于冰上放置20min，防止其復性；

3)熒光原位雜交：將步驟1)中的載玻片用2×SSC緩沖液處理兩次，每次5min，再依次用70％酒精、90％酒精、100％酒精梯度處理，每次5min，室溫晾干后滴加70％FA液，蓋上蓋玻片，于80℃處理2min；

之后依次用70％酒精、90％酒精、100％酒精梯度處理，每次5min，晾干后滴加10μL步驟2)的變性混合液，遮光下將載玻片于37℃恒溫箱中放置1.5～2h，依次用2×SSC緩沖液清洗3min、雙蒸水清洗3min，最后在常溫下晾干；