[發(fā)明專利]一種使用寡序列檢測林木染色體端部的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810319640.7
• 申請日: 2018-04-11
• 公開（公告）號: CN108441539B
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 羅小梅;陳亮;劉俊成;萬文林;龔偉;王景燕
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841;C12Q1/6895
• 代理公司: 成都天匯致遠知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 51264
• 代理人: 韓曉銀

1.一種使用寡序列檢測林木染色體端部的方法，其特征在于，該方法通過(AGGGTTT) ₃寡序列探針及包含該探針的試劑盒實現(xiàn)，所述(AGGGTTT) ₃寡序列探針的堿基序列為：5′-AGGGTTTAGGGTTTAGGGTTT-3′，用于識別并標記林木染色體端部；所述試劑盒包括：(1)所述探針；(2)酶解液；(3)20×SSC緩沖液；(4)2×SSC緩沖液；(5)70％FA液；(6)50％DS液；(7)鮭魚精DNA；所述林木為Croton tiglium、Erythrina crista-galli、Litseabaviensis、Litsea elongata、Podocarpusmacrophyllus、Quercusaquifolioides、Robiniapseudoacacia中的一種；所述方法包括以下步驟：

1)獲取林木染色體載玻片標本：剪取林木種子新生1.0～1.5cm根尖組織，依次用冰水混合物處理18～24h、冰醋酸處理5min，用雙蒸水清洗后，切取根尖分生組織1～2mm，置于酶解液中于37℃酶解45～60min；

去除酶解液，依次用雙蒸水、70％、90％、100％酒精依次清洗根尖分生組織，再加入冰醋酸制成根尖組織懸浮液，滴于載玻片上，晾干，鏡檢，將能清晰觀察到染色體的載玻片進行標記，并置于-20℃保存箱中保存；

2)變性：準備好滅菌的1.5mL離心管，每管加入2μL鮭魚精DNA，0.5μL探針，然后加入10μL100％FA、2μL 20×SSC和4μL50％DS，混勻后瞬時離心，于沸水浴中變性10min，立即置于冰上放置20min，防止其復性；

3)熒光原位雜交：將步驟1)中的載玻片用2×SSC緩沖液處理兩次，每次5min，再依次用70％酒精、90％酒精、100％酒精梯度處理，每次5min，室溫晾干后滴加70％FA液，蓋上蓋玻片，于80℃處理2min；

之后依次用70％酒精、90％酒精、100％酒精梯度處理，每次5min，晾干后滴加10μL步驟2)的變性混合液，遮光下將載玻片于37℃恒溫箱中放置1.5～2h，依次用2×SSC緩沖液清洗3min、雙蒸水清洗3min，最后在常溫下晾干；

4)信號檢測：晾干后的載玻片上加入DAPI，用熒光顯微鏡進行檢測，并采集檢測圖像；

5)回收載玻片：將載玻片置于2×SSC緩沖液中，60℃水浴10min，用70％、90％、100％酒精分別處理10min，之后于日光燈下放置24h，集中收集并置于-20℃保存箱中，以備下次使用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使用寡序列檢測林木染色體端部的方法，其特征在于，所述探針采用FAM標記其序列的5′端。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使用寡序列檢測林木染色體端部的方法，其特征在于，所述酶解液的配制方法為：每10mLddH₂O中加入2g纖維素酶和1g果膠酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使用寡序列檢測林木染色體端部的方法，其特征在于，所述20×SSC緩沖液的配制方法為：每1000mL的ddH₂O加入88.23g檸檬酸鈉和175.32g氯化鈉。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種使用寡序列檢測林木染色體端部的方法，其特征在于，所述2×SSC緩沖液的配制方法為：將20×SSC緩沖液稀釋10倍。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或者4所述的一種使用寡序列檢測林木染色體端部的方法，其特征在于，所述70％FA液由去離子甲酰胺和2×SSC緩沖液按照體積比7:3組成。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使用寡序列檢測林木染色體端部的方法，其特征在于，所述50％DS液的配制方法為：每500μL ddH₂O中加入0.5g硫酸葡聚糖，于37℃震蕩過夜，待完全融化后瞬時離心混勻。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使用寡序列檢測林木染色體端部的方法，其特征在于，所述鮭魚精DNA的處理方法為：將室溫下溶解的10mg/mL鮭魚精DNA高壓滅菌處理10min，沸水煮沸使其DNA變性10min，-20℃保存。