[發明專利]一種檢測嘔吐毒素及其乙酰化衍生物的時間分辨熒光免疫層析卡

在審

• 申請號: 201810318997.3
• 申請日: 2018-04-11
• 公開（公告）號: CN108614106A
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 張海濤;張一平;龔燕;董曼佳;楊婷婷;王紅連;陸麗婷;華洵璐;秦海萍;葉進;匡群
• 申請（專利權）人: 江蘇省蘇微微生物研究有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/577
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

1.一種檢測嘔吐毒素及其乙酰化衍生物的時間分辨熒光免疫層析卡，其特征在于所述層析卡包括由樣品墊（1）、標記墊（2）、硝酸纖維素NC膜（3）、吸水濾紙（4）和PVC底板（5）組成；所述標記墊（2）上固定有納米銪熒光微球標記的嘔吐毒素單克隆抗體1和抗體2；所述抗體1對嘔吐毒素DON和15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇15-Ac-DON表現出高度的特異性；所述抗體2對嘔吐毒素DON和3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇3-Ac-DON表現出高度的特異性；所述NC膜上噴涂有測試線T線（6）和控制線C線（7），T線固定有嘔吐毒素-牛血清白蛋白DON-BSA包被抗原，C線固定有羊抗鼠抗體IgG。

2.權利要求1所述檢測嘔吐毒素及其乙?；苌锏臅r間分辨熒光免疫層析卡的制備方法，其特征在于步驟為：

（1）樣品墊的制備：用含牛血清白蛋白BSA、吐溫-20的磷酸緩沖液，浸泡玻璃纖維或聚酯纖維材料墊，然后置于溫箱中烘干，獲得樣品墊；

（2）標記墊的制備：用含牛血清白蛋白BSA、吐溫-20的磷酸緩沖液，浸泡玻璃纖維或聚酯纖維材料墊，然后置于溫箱中烘干；將納米銪熒光微球標記的嘔吐毒素單克隆抗體1和抗體2，分別用含有海藻糖、蔗糖、BSA、吐溫-20的磷酸緩沖液稀釋，然后用噴金儀噴涂于該烘干后的材料墊上，置于溫箱中烘干，獲得標記墊；

（3）NC膜的制備：用含蔗糖的磷酸緩沖液，溶解包被抗原DON-BSA，使得濃度為0.4～0.8mg/mL；然后采用自動噴膜儀噴涂在NC膜上，噴量為0.5～3 μL/cm，得到T線；用相同的磷酸緩沖液，溶解羊抗鼠IgG，使得濃度為0.8～1.2 mg/mL；然后采用自動噴膜儀噴涂在距離T線右側3～5 mm位置處，噴量為0.5～3 μL/cm，得到C線；在溫箱內烘干，獲得NC膜；

（4）層析卡的組裝：以PVC 底板為襯板，將制備好的樣品墊、標記墊、NC膜與吸水濾紙，由左端依次粘貼在底板上，并且相互之間有1～3 mm的交聯，然后用切割機切割成一定尺寸的長條，裝于塑料卡殼中，用壓殼機壓緊。

3.根據權利要求2所述檢測嘔吐毒素及其乙酰化衍生物的時間分辨熒光免疫層析卡的制備方法，其特征在于步驟（2）中使用的納米銪熒光微球為表面帶有羧基的聚苯乙烯熒光微球，是通過以下步驟獲得的：首先采用β-二酮類螯合劑BHHCT 4,4′-二(1″,1″,1″,2″,2″,3″,3″-七氟-4″,6″-己二酮-6″-酰基) -氯磺化鄰三聯苯與烯丙基胺NH₂CH₂CH=CH₂反應，引入C=C雙鍵，制備成可聚合的螯合物單體；再與EuCL₃反應，轉化為基于銪離子發光原理的可聚合熒光螯合物單體；然后采用分散聚合法結合超聲波輻照技術，在聚乙烯吡咯烷酮PVP、偶氮二異丁腈AIBN的參與下，與苯乙烯單體共價結合，制備出小粒徑聚苯乙烯熒光微球；最后采用十一烯酸包覆法，利用微球表面的雙鍵與十一烯酸的雙鍵共聚，實現十一烯酸在微球表面的包覆，從而制備出羧基聚苯乙烯熒光微球；該微球直徑為70～100 nm，變異系數CV值＜5%，激發和發射波長分別為365 nm和615 nm。

4.根據權利要求2所述檢測嘔吐毒素及其乙?；苌锏臅r間分辨熒光免疫層析卡的制備方法，其特征在于步驟（2）中使用的嘔吐毒素單克隆抗體1和抗體2，是分別采用抗嘔吐毒素雜交瘤細胞株SW-3 F4及SW-3 G12，經過體外培養、小鼠腹腔注射、采集腹水、提取純化、抗體特異性鑒定而獲得的；其中，抗體1與嘔吐毒素DON交叉反應率100%，與15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇15-Ac-DON的交叉反應率≥100%，對DON和15-Ac-DON表現出高度的特異性；抗體2與嘔吐毒素DON交叉反應率100%、與3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇3-Ac-DON的交叉反應率≥100%，對DON和3-Ac-DON表現出高度的特異性。