[發明專利]檢測馬鈴薯M病毒用的引物、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201810317468.1
• 申請日: 2018-04-10
• 公開（公告）號: CN108300810A
• 公開（公告）日: 2018-07-20
• 發明（設計）人: 陳定虎
• 申請（專利權）人: 陳定虎
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 中山市興華粵專利代理有限公司 44345
• 代理人: 吳劍鋒

1.一種檢測馬鈴薯M病毒用的引物，其特征在于包括：

PVM-F3:5’-TATGAGGACCGGTTCGCC-3’

PVM-B3:5’-GACCATTCATACCGCCAGTC-3’

PVM-FIP:5’-CGGGGTTGGTCGCCTTATCAG-TTACGTGGAGAACACTGCTG-3’

PVM-BIP:5’-AAGGACGTGGCTTTACGTGGT-ACCTCGGCATTAAGAGAGCT-3’。

2.一種檢測馬鈴薯M病毒用的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括有：

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的2×反應液緩沖液由以下組分組成：

4.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的酶溶液為Bst DNA聚合酶和AMV逆轉錄酶混合液。

5.根據權利要求2至4所述的任一種試劑盒，其特征在于熒光目視檢測試劑中含有鈣黃綠素熒光染料。

6.一種馬鈴薯M病毒檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

A、植物組織總DNA提取；

B、LAMP檢測：

采用權利要求2所述的試劑盒配置預反應溶液，在預反應溶液中分別加入待檢測的樣品的DNA 5μL，使總量達到25μL；其中對照組在預反應溶液加入去離子水5μL；陽性對照在預反應溶液中加入帶病毒的DNA 5μL；用移液器吸排液法混合，或者合上蓋子輕擊使溶液充分混合后瞬時離心，混合時避免產生氣泡；將混合物置于反應孔中，于65℃恒溫反應90min，最后80℃下保溫5min以結束反應；

C、LAMP結果判斷

擴增反應結束后，使用紫外線照射裝置，波長240-260nm，350-370nm，從反應試管底部向上進行紫外線照射，佩戴眼鏡等防護用具后從反應試管側面進行觀察，若與陽性對照一樣發出綠色熒光，則判定為陽性即樣品中帶有馬鈴薯M病毒；若與陰性對照一樣未發出綠色熒光，則判定樣品中沒有攜帶馬鈴薯M病毒。

7.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于步驟A中植物組織總DNA提取的具體步驟：

a制樣：取0.5g的帶毒組織加入1mL抽提緩沖液進行研磨；

b清洗納米磁珠：取出免疫納米磁珠到PCR管中，用ddH₂O反復清洗納米磁珠3次，在磁鐵的作用下吸去ddH₂O；

c結合：加入100μL的樣品到PCR管中，用移液槍吸吐混勻樣品和納米磁珠，室溫下吸附；

d清洗：在磁鐵的作用下移去上清，納米磁珠清洗3次；

e裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液槍吸吐混勻納米磁珠后，95℃，10min；

f取樣：用磁鐵吸附納米磁珠，待PCR管內溶液澄清后，上清即為病毒RNA；

g核酸濃度的測定

取5μL DNA溶液加ddH₂O梯度稀釋至1mL，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計測260nm和280nm處的光密度值；RNA的濃度按照以下公式計算獲得：

RNA C＝40×N×A

式中：

C——RNA濃度(ng/μL)

A——260nm處的吸光值

N——核酸稀釋倍數

1OD_260nm＝40μg/mL單鏈RNA

當OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.7～1.9之間時，適宜于PCR擴增和LAMP檢測。

8.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于所述納米磁珠通過以下方法制備：

1)Fe₃O₄磁性納米粒子制備與氨基化修飾

分別取5.2g FeCl₃·6H₂O、2.7g FeSO₄·7H₂O、0.85mL 12.1moL/L的濃鹽酸溶解于200mL水中，超聲脫氧，后將以上溶液滴入250mL、0.75moL/L NaOH溶液；所有反應在80℃下攪拌，隨著反應的進行，反應液中出現黑色的沉淀，反應結束后，利用磁分離器將所得沉淀從反應介質中分離出來，再用去離子水清洗3次，無水乙醇清洗2次，并配成5g/mL的Fe₃O₄磁性納米粒子無水乙醇溶液，取25mL Fe₃O₄磁性納米粒子無水乙醇溶液，再用無水乙醇稀釋到150mL，超聲振蕩30min，滴加0.4mL APTES，其中硅烷偶聯劑：3-氨基丙基三乙氧基硅烷，室溫下攪拌7h，反應完畢，用磁分離器將APTES修飾的Fe₃O₄磁性納米粒子從反應介質中分離，并用無水乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5mg/mL的氨基化Fe₃O₄納米磁珠無水乙醇溶液；

2)免疫磁珠的制備

取0.5mL氨基化Fe₃O₄納米磁珠無水乙醇溶液，用1mL PBS清洗3次，磁分離器棄上清液，加入5％(V/V)戊二醛溶液2mL，室溫振蕩交聯2h，磁分離，棄上清液，用PBS洗滌3次并棄上清液后，分別采用0.5mL不同稀釋倍數的相應病毒抗體包被氨基化Fe₃O₄納米粒子，室溫下振蕩固定2h，磁分離，用PBS和超純水分別洗滌3次，再用PBS定容，4℃冰箱保存備用，到具有最佳吸附量的一病毒抗體免疫磁珠。