[發(fā)明專利]一種可檢測熱原的單克隆細(xì)胞系的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810317034.1
• 申請日: 2018-04-10
• 公開（公告）號: CN108707626B
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 方敏;李凱莉;王滔;徐赫男;姜威;李晶;劉文軍;段學(xué)鋒
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院微生物研究所;安徽大學(xué);中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院湖州營養(yǎng)與健康產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新中心
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12Q1/02
• 代理公司: 北京律和信知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11446
• 代理人: 武玉琴;劉國偉

1.一種可檢測熱原的單克隆細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，包括：

（1）將NF-κB結(jié)合位點或者IFN-β啟動子序列組裝到可表達(dá)嘌呤霉素的慢病毒表達(dá)載體中，構(gòu)建含有NF-κB結(jié)合位點或者IFN-β啟動子序列的重組質(zhì)粒；

（2）將步驟(1)得到的重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到上皮細(xì)胞系中；

（3）將步驟(2)得到的上皮細(xì)胞系使用嘌呤霉素篩選，并用流式分選單克隆細(xì)胞；

（4）將步驟(3)得到的單克隆細(xì)胞使用高劑量的LPS刺激，其中對LPS有反應(yīng)的則為NF-κB或者IFN-β陽性克隆；

（5）將步驟（4）得到的陽性克隆使用更低劑量的LPS刺激，得到極靈敏的陽性克隆細(xì)胞；

所述慢病毒表達(dá)載體為pCDH-CMV-MCS-EF1系列載體；

所述上皮細(xì)胞系為人肺泡上皮細(xì)胞A549。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的NF-κB結(jié)合位點或者IFN-β啟動子序列分別克隆自pNFκB-luc 或者pGL3-Control 質(zhì)粒。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高劑量的LPS，其濃度為500ng/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的對LPS有反應(yīng)是通過熒光素酶報告實驗測定。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的更低劑量LPS，其濃度分別為1,10,50，100 ng/ml或者10,25，50，100 ng/ml。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的LPS刺激，其時間為6h。