[發明專利]一種可檢測熱原的單克隆細胞系的制備方法

有效

• 申請號: 201810317034.1
• 申請日: 2018-04-10
• 公開（公告）號: CN108707626B
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 方敏;李凱莉;王滔;徐赫男;姜威;李晶;劉文軍;段學鋒
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所;安徽大學;中國科學院上海生命科學研究院湖州營養與健康產業創新中心
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12Q1/02
• 代理公司: 北京律和信知識產權代理事務所(普通合伙) 11446
• 代理人: 武玉琴;劉國偉

本發明公開了一種可檢測熱原的單克隆細胞系的制備方法。該方法主要通過慢病毒構建穩定細胞系的方式，使得在NF?κB反應元件或者IFN?β啟動子控制下的熒光素酶基因穩定表達在人上皮細胞A549細胞中，然后通過流式篩選得到單克隆，進一步篩選對LPS有反應的陽性克隆子，最后使用細菌內毒素標準品刺激并同時和鱟試劑進行比較，從而建立了一種新的使用上皮細胞系檢測熱原的方法。所述的上皮細胞系檢測熱原的方法不需要使用動物就能夠真實地模擬人體對熱原的反應，并且能夠對的分布范圍極為廣泛的LPS有較強的反應，靈敏度高，穩定性好，而且A549細胞市售易得使該熱原檢測方法簡單易行。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及藥品和生物制品(包括基因工程制品)中熱原的檢測技術領域.

背景技術

熱原是一類在宿主體內可以引起發熱和誘導炎癥反應的異構類化合物。藥品和醫療器械熱原的污染是系統性炎癥最常見的原因，甚至更糟糕的是會引起敗血性休克(Palma,L.,et al.Assay Drug Dev Technol,2017.15(2):64-76.；Gimenes,I.,etal.Regul Toxicol Pharmacolm,2015.73(1):356-360.)。大多數為我們所知道的熱原是微生物來源的，包括細菌，酵母，真菌，病毒和它們的組分以及環境顆粒(Daneshian,M.,etal.J Immunol Methods,2008.336(1):64-70.)。研究最好的是細菌細胞壁的組分，例如革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS，也被稱為內毒素)或者革蘭氏陽性菌的脂磷壁酸(LTA)和肽聚糖(PGN)(Daneshian,M.,et al.J Immunol Methods,2008.336(1):64-70.；Stang,K.,etal.J Mater Sci Mater Med,2014.25(4):1065-1075.)，這些熱原物質會刺激宿主的白細胞去釋放炎癥細胞因子和導致嚴重的反應，如多器官衰竭，敗血性休克甚至死亡(Stang,K.,et al.J Mater Sci Mater Med,2014.25(4):1065-1075.；Hasiwa,N.,M.Daneshian,and T.Hartung,2013.30(2):169-209.)。因此，熱原檢測是一個醫藥產品的先決條件。目前，幾種不同的檢測熱原方法可以被獲得，分別是家兔熱原檢測法(RPT)，細菌內毒素檢測法(BET，也被稱為鱟試劑法(LAL))，和單核細胞檢測法(MAT)(Stang,K.,et al.J MaterSci Mater Med,2014.25(4):1065-1075.)。

家兔熱原檢測法(RPT)，一個黃金的熱原檢測標準，它是基于在靜脈注射待檢測的溶液或者移植醫療器械之后觀察家兔溫度的上升情況(Stang,K.,et al.J Mater SciMater Med,2014.25(4):1065-1075.；Su,W.and X.Ding,2015.20(4):354-364.)。在二十世紀初，由于家兔對熱原的靈敏度和人類的靈敏度是相似的(Vipond,C.,et al.,ALTEX,2016.33(1):47-53.)，因此，RPT被應用于檢測不同類型的熱原污染(Palma,L.,etal.Assay Drug Dev Technol,2017.15(2):64-76.)。然而，家兔的靈敏度容易受到很多因素影響，例如家兔的品系，年齡和性別以及飼養條件等(Stang,K.,et al.J Mater SciMater Med,2014.25(4):1065-1075.)。而且，RPT是既昂貴又費時的。除此之外，家兔法僅僅是定性檢測而不是定量的(Hasiwa,N.,M.Daneshian,and T.Hartung,2013.30(2):169-209.)。