[發明專利]一種黑枸杞不定芽途徑高效誘導多倍體的方法

有效

• 申請號: 201810315863.6
• 申請日: 2018-04-10
• 公開（公告）號: CN108496801B
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 陳金煥;饒書培
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京市廣友專利事務所有限責任公司 11237
• 代理人: 張仲波

1.一種黑枸杞不定芽途徑高效誘導多倍體的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、剪取黑果枸杞無菌苗從上至下第4-5片幼嫩葉片，剪去葉片兩端獲得傷口后接種于葉片分化培養基中預培養，至葉片膨大生長出少量綠色愈傷組織；其中，葉片分化培養基的成分為：MS基本培養基+0.1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.5mg/L KT；

S2、將獲得的帶愈傷組織的葉片轉移至含1％(v/v)的DMSO和秋水仙堿的液體葉片分化培養基中進行多倍體浸泡誘導，秋水仙堿濃度為50mg/L，避光黑暗條件處理1-2天；然后使用無菌水清洗葉片后轉入上述葉片分化培養基，繼續22-26℃光照培養至長出不定芽；

S3、將加倍過后的不定芽轉入生根培養基中，22-26℃生長至不定芽高度達到3cm時進行多倍體檢測，以獲得多倍體再生植株；其中，生根培養基的成分為：1/2MS基本培養基+0.1mg/L IBA；其中，

步驟S1中，預培養時間為8-11天；

步驟S3中，不定芽的生根培養的時間為10天。

2.根據權利要求1所述的黑枸杞不定芽途徑高效誘導多倍體的方法，其特征在于，所述步驟S3中，多倍體檢測用流式細胞儀和根尖染色體計數法實現。

3.根據權利要求2所述的黑枸杞不定芽途徑高效誘導多倍體的方法，其特征在于，流式細胞儀檢測用染液為10μg/mL的DAPI染液，流式細胞儀所用的裂解液配方為：

裂解液成分	配置1L含量
2·6H2O]]>	9.14g
MOPS	4.19g
3C6H5O7]]>	7.74g
Triton X-100	5ml
PVP-40	10g

。

4.根據權利要求2所述的黑枸杞不定芽途徑高效誘導多倍體的方法，其特征在于，所述根尖染色體計數方法的具體步驟為：

1)預處理：植株根長至1-1.5cm時剪取0.5cm根尖置于對二氯苯水溶液4℃處理4h；

2)固定：將根尖用卡諾固定液固定24h后用蒸餾水洗3次；

3)解離：在60℃條件下用1M HCl處理根尖12-15min，清水洗4次；

4)壓片：取出根尖，切去根冠和伸長區，用解剖針輕戳根尖，滴一滴改良苯酚品紅，染色10-15min后蓋上蓋玻片，施加少量壓力使細胞舒展，100x物鏡觀察獲得的變異株組培苗根尖細胞的中期染色體數目。